בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.
עם העלייה בשכיחות, מחלות מעי דלקתיות (IBD), שהן מחלות כרוניות המשפיעות על מערכת העיכול, מטילות נטל בריאותי וכלכלי ניכר על יחידים וחברה. לכן, זה קריטי לחקור את המנגנונים שבבסיס הפתוגנזה ופיתוח של IBD. כאן מתואר מודל קוליטיס של העברת תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים אנטיגן. CBir1 flagellin הוכר כאנטיגן חיידקי המעיים האימונודומיננטי בקוליטיס ניסיוני וחולים עם מחלת קרוהן. CBir1 TCR מהונדס naϊve CD4+ תאי T, ספציפיים ל- CBir1 flagellin, יכולים לגרום לקוליטיס כרונית לאחר העברה מאמצת לעכברים Rag1-/- לקויי מערכת החיסון. חומרת המחלה מוערכת על ידי היסטופתולוגיה. הפנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופריה המעי הגס נקבעים גם הם. מודל זה דומה מאוד להתפתחות של מחלת המעי הרגיז, המספקת מודל מורין אידיאלי לחקירת המנגנונים המניעים את הפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז ובדיקת התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.
מחלות מעי דלקתיות (IBD), בעיקר כולל מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC), מאופיינות בדלקת כרונית, חוזרת ונשנית של מערכת העיכול, המשפיעה על מיליונים ברחבי העולם1. מספר גורמים היו מעורבים בהתפתחות ובפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז, כולל רגישות גנטית, מיקרוביוטה במעיים, תגובות חיסוניות, תזונה ואורח חיים2. עם זאת, המנגנון המדויק של IBD עדיין לא מובן לחלוטין.
אחד האינטרסים הספציפיים הוא האינטראקציה בין מיקרוביוטה במעיים ותגובות חיסוניות מארחות בוויסות דלקת מעיים3. מיקרוביוטה במעיים מספקת סדרה של מולקולות ואנטיגנים אימונוסטימולטוריים, שיכולים להפעיל תגובות חיסוניות4. בעוד שהאיזון בין תאי T משפיעים לתאי T תקינים (Tregs) הוא קריטי בשמירה על הומאוסטזיס מעיים, תגובת תאי רירית המעיים המוגזמת CD4+ T לאנטיגנים של מיקרוביוטה במעיים תורמת לדלקת מעיים 5,6,7. כאנטיגן מיקרוביוטה מעיים אימונודומיננטי, CBir1 flagellin היה קשור לפתוגנזה של CD8,9 אנושי. יתר על כן, העברה של תאי TCR מהונדסים CBir1 TCR (Tg) T גורמת לדלקת מעיים בעכברים לקויים במערכת החיסון6, הדומה מאוד ל- IBD האנושי, המציין כי מודל העברת תאי T זה מסייע לחקור את המנגנונים של מחלת המעי הרגיז האנושית.
עבודה זו מתארת את הפרוטוקול המפורט של גרימת קוליטיס ב Rag1-/- עכברים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + תאי T והערכה של חומרת המחלה. חוץ מזה, התוצאות הצפויות מוצגות, ואת השלבים הקריטיים של ההליך ופתרון בעיות נדונים, אשר יסייע לחוקרים לחקור את המנגנונים של פתוגנזה של דלקת מעיים ולבדוק את התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.
למרות כל צעד חיוני עבור רבייה של מודל קוליטיס זה, ישנם מספר צעדים קריטיים. הנמען Rag-/- עכברים צריכים לקבל נאותה naϊve CD4 + תאי T כדי לגרום לדלקת מעיים. השתמשנו בטחול לבידוד של תאי CD4 + T נאיביים במקום MLNs. כי התשואה של תאי CD4+ T נאיביים ב- MLNs נמוכה בהרבה מאשר בטחול. CD62L מתבטא …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מעניקים DK125011, AI1502110, ו- DK124132, פרס STARs מערכת אוניברסיטת טקסס (Y.C.), וקרן מלגת ג’יימס ו. מקלפלין מהסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון (W.Y.). איור 1 נוצר עם BioRender.com.
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | ||
EDTA | Corning | 46-034-CI | |
EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
FBS | R&D Systems | S11550 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |