אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים
Summary
בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.
Abstract
עם העלייה בשכיחות, מחלות מעי דלקתיות (IBD), שהן מחלות כרוניות המשפיעות על מערכת העיכול, מטילות נטל בריאותי וכלכלי ניכר על יחידים וחברה. לכן, זה קריטי לחקור את המנגנונים שבבסיס הפתוגנזה ופיתוח של IBD. כאן מתואר מודל קוליטיס של העברת תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים אנטיגן. CBir1 flagellin הוכר כאנטיגן חיידקי המעיים האימונודומיננטי בקוליטיס ניסיוני וחולים עם מחלת קרוהן. CBir1 TCR מהונדס naϊve CD4+ תאי T, ספציפיים ל- CBir1 flagellin, יכולים לגרום לקוליטיס כרונית לאחר העברה מאמצת לעכברים Rag1-/- לקויי מערכת החיסון. חומרת המחלה מוערכת על ידי היסטופתולוגיה. הפנוטיפים של תאי CD4+ T בלמינה פרופריה המעי הגס נקבעים גם הם. מודל זה דומה מאוד להתפתחות של מחלת המעי הרגיז, המספקת מודל מורין אידיאלי לחקירת המנגנונים המניעים את הפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז ובדיקת התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.
Introduction
מחלות מעי דלקתיות (IBD), בעיקר כולל מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC), מאופיינות בדלקת כרונית, חוזרת ונשנית של מערכת העיכול, המשפיעה על מיליונים ברחבי העולם1. מספר גורמים היו מעורבים בהתפתחות ובפתוגנזה של מחלת המעי הרגיז, כולל רגישות גנטית, מיקרוביוטה במעיים, תגובות חיסוניות, תזונה ואורח חיים2. עם זאת, המנגנון המדויק של IBD עדיין לא מובן לחלוטין.
אחד האינטרסים הספציפיים הוא האינטראקציה בין מיקרוביוטה במעיים ותגובות חיסוניות מארחות בוויסות דלקת מעיים3. מיקרוביוטה במעיים מספקת סדרה של מולקולות ואנטיגנים אימונוסטימולטוריים, שיכולים להפעיל תגובות חיסוניות4. בעוד שהאיזון בין תאי T משפיעים לתאי T תקינים (Tregs) הוא קריטי בשמירה על הומאוסטזיס מעיים, תגובת תאי רירית המעיים המוגזמת CD4+ T לאנטיגנים של מיקרוביוטה במעיים תורמת לדלקת מעיים 5,6,7. כאנטיגן מיקרוביוטה מעיים אימונודומיננטי, CBir1 flagellin היה קשור לפתוגנזה של CD8,9 אנושי. יתר על כן, העברה של תאי TCR מהונדסים CBir1 TCR (Tg) T גורמת לדלקת מעיים בעכברים לקויים במערכת החיסון6, הדומה מאוד ל- IBD האנושי, המציין כי מודל העברת תאי T זה מסייע לחקור את המנגנונים של מחלת המעי הרגיז האנושית.
עבודה זו מתארת את הפרוטוקול המפורט של גרימת קוליטיס ב Rag1-/- עכברים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + תאי T והערכה של חומרת המחלה. חוץ מזה, התוצאות הצפויות מוצגות, ואת השלבים הקריטיים של ההליך ופתרון בעיות נדונים, אשר יסייע לחוקרים לחקור את המנגנונים של פתוגנזה של דלקת מעיים ולבדוק את התרופות הפוטנציאליות לטיפול במחלת המעי הרגיז.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות כל צעד חיוני עבור רבייה של מודל קוליטיס זה, ישנם מספר צעדים קריטיים. הנמען Rag-/- עכברים צריכים לקבל נאותה naϊve CD4 + תאי T כדי לגרום לדלקת מעיים. השתמשנו בטחול לבידוד של תאי CD4 + T נאיביים במקום MLNs. כי התשואה של תאי CD4+ T נאיביים ב- MLNs נמוכה בהרבה מאשר בטחול. CD62L מתבטא …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מעניקים DK125011, AI1502110, ו- DK124132, פרס STARs מערכת אוניברסיטת טקסס (Y.C.), וקרן מלגת ג’יימס ו. מקלפלין מהסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון (W.Y.). איור 1 נוצר עם BioRender.com.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. . Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells’ differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn’s disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. . Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn’s disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. . T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
