Summary
تم تأكيد تقييم مراقبة الجودة لمزارع بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) كطريقة فعالة لتعزيز صلاحية ووظائف سلالات LAB لإجراءات التخمير. لدعم هذا التأكيد ، قمنا بتطوير بروتوكول يوضح كيفية تنشيط مزارع LAB وزراعتها لإجراءات التخمير والمعالجة الحيوية.
Abstract
بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) هي مزارع أساسية لبداية الألبان تستخدم بشكل كبير لتصنيع منتجات الألبان المخمرة مثل الزبادي والجبن. تنتج LAB في الغالب حمض اللاكتيك كمنتج نهائي رئيسي للتخمير ، وتقوم بتوليف المستقلبات المهمة التي تنقل الخصائص الحسية للمنتجات الغذائية المخمرة. LAB هي بكتيريا شديدة الحساسية تزدهر في العديد من البيئات عندما يتم تلبية المتطلبات الغذائية الكافية. أدى الطلب على مزارع بداية الألبان LAB المتفوقة لتطبيقات التخمير في صناعة الأغذية والألبان إلى الحاجة إلى توفير مزارع قابلة للحياة ونشطة لجميع عمليات المعالجة الحيوية. وبالتالي فإن تطوير بروتوكول قياسي لضمان الجدوى والوظائف المحسنة لمزارع LAB في المختبر وكذلك بيئات معالجة الألبان أمر بالغ الأهمية. في معالجة المخاوف المرتبطة بإنعاش خلايا زراعة LAB الضعيفة والمجهدة والمصابة ، فإن البروتوكول الذي يحدد بوضوح الخطوات البارزة للتعافي ، وتعزيز تجديد الخلايا ، وتحسين وظائف التمثيل الغذائي لسلالات LAB له أهمية قصوى. يعد الحفاظ على نقاء الثقافة ووظائفها وصلاحيتها لثقافات بداية LAB أمرا بالغ الأهمية أيضا. لذلك ، سيؤدي الالتزام بإرشادات بروتوكول فريدة إلى تعزيز أداء التخمير للعديد من سلالات LAB المخصصة لعمليات التخمير والتكنولوجيا الحيوية. نتيجة لذلك ، طور مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية للزراعة والتقنية بروتوكولا قياسيا لتنشيط ومراقبة جودة سلالات LAB المختارة التي أدت إلى سلالات ثقافة LAB عالية الأداء وقابلة للحياة تستخدم في أبحاث التخمير. سيساعد تكييف بروتوكول مثل هذا والتوصية به للاستخدام في صناعة الألبان والأغذية على ضمان صلاحية LAB ووظائفه للعديد من التطبيقات.
Introduction
بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) هي مجموعة من البكتيريا المتنوعة بشكل فريد والتي لديها إمكانات صناعية. تستخدم السلالات التي تنتمي إلى Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus و Streptococcus thermophilus في الغالب كمزارع بداية الألبان لمنتجات الألبان الغذائية المخمرة مثل الزبادي1. تصنف سلالات LAB المختارة أيضا على أنها بروبيوتيك لأنها تمنح فوائد صحية للبشر عندما يتم إعطاء الجرعات بشكل كاف2. بكتيريا حمض اللاكتيك هي أيضا كائنات دقيقة إيجابية الجرام ، وغير مكونة للأبواغ ، وغير قابلة للتنفس ولكنها متحملة للهواء تتميز عموما بإنتاج حمض اللاكتيك كمنتج تخمير رئيسي. يقوم LAB أيضا بتصنيع المستقلبات الأساسية ، على سبيل المثال ، الأحماض العضوية ، والبكتيريا ، والمركبات المضادة للميكروباتالأخرى 3 التي يمكن أن تمنع مجموعة واسعة من مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء4. حمض اللاكتيك ، وهو منتج نهائي رئيسي لهدم الكربوهيدرات ومنتج ثانوي لتخمير LAB ، هو مستقلب عضوي يمتلك خصائص مضادة للميكروبات ويحتمل أن يكون مفيدا لتطبيقات الحفظ الحيوي للأغذية3،5،6. علاوة على ذلك ، فإن الأحماض العضوية التي تنتجها LAB تضفي نكهة وملمس ورائحة الأطعمة ، وبالتالي تعزز خصائصها الحسية الشاملة 5,6. المتطلبات الغذائية المتميزة ل LAB إلى جانب طبيعتها في كل مكان ، تمكن البكتيريا في النهاية من الازدهار بسهولة في بيئات مختلفة مثل الأطعمة القائمة على الألبان والأطعمة المخمرة والخضروات وكذلك في الأمعاء البشرية7.
هناك طلب متزايد على الثقافات البادئة من LAB لإنتاج الزبادي والعديد من تطبيقات الألبان المتنوعة 8,9 ، وبالتالي يجب الالتزام بالاهتمام النقدي والتقنيات العلمية الراسخة ، في زراعة سلالات LAB ، وكذلك في تنشيط كل من السلالات المجففة بالتجميد والمعزولة لأن هذا النشاط حيوي لتحسين أداء التخمير. لذلك ، يشارك مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية بنشاط في تطوير التكنولوجيا المناسبة الموجهة نحو التنشيط والنمو الفائق وخاصية التخمير لسلالات LAB المعزولة من منتجات الألبان المخمرة وكذلك من مزارع المبتدئين الصناعية المستخدمة لإنتاج الزبادي. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن سلالات زراعة LAB المنتجة صناعيا تخضع لأنشطة حافظة مثل التجفيف بالتجميد والتخزين المجمد ، مما يتسبب في إجهاد الخلايا وإصابتها ، نتيجة لعملية الصدمة الباردة التي تتعرض لها10. في الحد من تحديات الجدوى وتحسين وظائف سلالات LAB التي تم الحصول عليها إما من المنتجات الغذائية المعزولة أو المنتجات المجففة بالتجميد ، من المهم تنشيط هذه الثقافات بشكل صحيح كشكل من أشكال مراقبة الجودة لتعزيز خصائصها التخمرية8. في هذه الدراسة ، كان الهدف هو تطوير بروتوكول داخلي لمراقبة الجودة لتنشيط ونمو سلالات الاستزراع البلغارية الفرعية L. delbrueckii التي عززت في النهاية نمو LAB القابل للحياة ، بالإضافة إلى تعزيز أداء التخمير والوظيفة الأيضية لسلالات LAB. يمكن تكييف هذا البروتوكول في النهاية (باستخدام وسائط النمو المثلى وظروف الزراعة المناسبة) لزراعة سلالات LAB الأخرى لأبحاث التخمير ، وكذلك للأغراض الصناعية أو عمليات المعالجة الحيوية. وبالتالي ، سيضمن بروتوكول تنشيط ومراقبة الجودة LAB هذا الحصول على ثقافات بداية منتجات الألبان الفائقة القابلة للتطبيق والتي يمكن أن تكون وظيفية لتطبيقات متنوعة في صناعة الألبان والأغذية العالمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المواد والأساليب العامة
- مصدر اكتوباسيلوس ديلبروكي subsp. البلغارية
- الحصول على سلالات L. bulgaricus من مصادر موثوقة.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام ما مجموعه خمس (5) سلالات L. bulgaricus في دراسة مراقبة الجودة (الجدول 1). تم توفير سلالتين من L. bulgaricus المجفف بالتجميد للإنتاج الصناعي لمنتجات الحليب المخمر من قبل الدكتور ألبرت كراستانوف ، قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة تقنيات الأغذية ، بلوفديف ، بلغاريا. تم الحصول على سلالتين معزولتين من منتجات الزبادي التجارية المتوفرة في سوق الولايات المتحدة من مخزون -80 درجة مئوية من مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية A&T وتم توفير سلالة واحدة مجففة بالتجميد من قبل البائع C. تم الاحتفاظ بجميع سلالات LAB عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. كما تم تقييم سلالة بكتيرية أخرى (Limosilactobacillus reuteri) من مخزون -80 درجة مئوية من مختبر علم الأحياء الدقيقة الغذائية والتكنولوجيا الحيوية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية A&T.
- الحصول على سلالات L. bulgaricus من مصادر موثوقة.
- معيار L. MRS مرق التخمير المتوسطة
- تحضير deMan، Rogosa Sharpe (MRS) المتوسطة عن طريق إذابة تماما 55 غرام من MRS، و 0.5 غرام من L-Cysteine في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DW).
- قم بتوزيع 7 مل و 2 مل من محلول MRS المحضر في أنابيب الاختبار ، على التوالي ، الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة (RT).
- MRS أجار المتوسطة
- تحضير MRS أجار المتوسطة عن طريق إذابة تماما 55 غرام من MRS و 0.5 غرام من L-Cysteine في 1 L من DW. أضف مسحوق أجار (15 جم) ، وعقم وسط الآجار عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتبريده في حمام مائي.
- صب جميع الوسائط الطازجة في أطباق بتري معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الحاجة إليها.
- تعديل كلوستريديال متوسط البيروفات المقوى (mRCM-PYR)
- تحسين وسط كلوستريديال مقوى وفقا ل Oyeniran et al.13 و Nwamaioha و Ibrahim18 ، من أجل الانتقائية والتعداد الدقيق ل L. bulgaricus عن طريق إذابة 10 جم من الببتون # 3 ، 10 جم من مستخلص اللحم البقري ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 3 جم من أسيتات الصوديوم ، 2 جم من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، 0.1 غرام من اليوراسيل ، 0.25 غرام من كلوريد الكالسيوم ، 5 غرام من سكر العنب ، 5 غرام من الفركتوز ، 10 غرام من المالتوز ، 2 غرام من بيروفات الصوديوم ، 0.2 ٪ توين 80 ، و 0.5 غرام من L- السيستين في 1 لتر من DW.
- اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي (6.0 ± 0.2) للمحلول باستخدام 6 N HCl قبل إضافة 0.008٪ أزرق أنيلين و 15 جم من أجار. الأوتوكلاف الوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، تبرد في حمام مائي ، وتصب في أطباق بتري معقمة. قم بتخزين جميع الوسائط الطازجة في أطباق بتري معقمة على حرارة 4 درجات مئوية لمجرد الحاجة.
- مخزون الجلسرين من مزارع LAB
- تحضير مخزون الجلسرين (50٪ جلسرين) عن طريق تخفيف 100٪ جلسرين في نفس الحجم من DW وتعقيمه عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام دورة تعقيم جافة. قم بتبريد مخزون الجلسرين إلى RT وقم بتخزينه بشكل معقم للاستخدام مرة أخرى.
- استخدم النمو البكتيري (مستعمرة واحدة من L. bulgaricus تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة المطور) من الثقافات الليلية.
- ماصة 500 ميكرولتر من الثقافات الليلية إلى 50٪ جلسرين في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل واخلطها معا برفق. قم بتجميد وتخزين مخزون الجلسرين الذي يحتوي على مزارع LAB في درجة حرارة منخفضة للغاية تبلغ -80 درجة مئوية لآخر حاجة.
ملاحظة: يظهر في الشكل 1 مخطط رسومي لبروتوكول مراقبة الجودة وتفعيل ثقافات LAB.
| لا | رمز المنتج | عينة | مصدر | التركيب البكتيري كما هو موضح1 |
| 1 | م9 | سلالة صناعية نقية | بلغاريا | رطل بلغاريكوس |
| 2 | رطل 6 | سلالة صناعية نقية | بلغاريا | رطل بولغاريكوس ، |
| 3 | ATCC 11842 | سلالة صناعية نقية | إيه تي سي سي | رطل بلغاريكوس |
| 4 | داو | زبادي | الولايات المتحدة الأمريكية | Lb. بلغاريا ، ثقافة حية أخرى |
| 5 | اي 22 | زبادي | الولايات المتحدة الأمريكية | Lb. بلغاريا ، ثقافة حية أخرى |
| 6 | روتيري | زبادي | الولايات المتحدة الأمريكية | ليموسيلاكتوباكيللوس روتيري |
| 1رطل = الملبنة | ||||
الجدول 1: سلالات بروبيوتيك. يسرد الجدول سلالات البروبيوتيك المستخدمة في هذه الدراسة.
2. بروتوكول تفعيل ومراقبة جودة مزارع LAB
- خذ مخزون الجلسرين المحضر من سلالات LAB (في أنابيب طرد مركزي سعة 2 مل) من الفريزر المنخفض للغاية -80 درجة مئوية ، ولا تسمح لها بالذوبان قبل الاستخدام.
- قم بتنظيف وتطهير فتحة أنابيب الطرد المركزي بنسبة 70٪ كحول ، ودوامة بلطف قبل الاستخدام.
- ماصة حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من مخزون LAB من أنابيب الطرد المركزي إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 2 مل.
- دوامة برفق ، بارافيلم أنابيب الاختبار ، واحتضانها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- خذ حوالي 500 ميكرولتر (0.5 مل) من المزارع المزروعة بين عشية وضحاها من أنابيب اختبار MRS سعة 2 مل إلى أنابيب اختبار MRS سعة 7 مل ، دوامة ، واحتضانها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- تقييم النمو الميكروبي عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) أو نمو الثقافات عند 610 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية وتسجيل نتائج مقبولة بين 0.7 و 0.9.
- قم بترتيب المزارع الليلية من أنابيب MRS سعة 7 مل على ألواح أجار MRS و MRCM-PYR واحتضانها لاهوائيا لمدة 72 ساعة عند 42 درجة مئوية.
- اختر مستعمرات معزولة من ألواح الآجار ، وانقلها إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 7 مل ، ودوامة برفق ، واحتضنها لاهوائيا طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
- قم بتخزين ألواح الآجار التي تحتوي على السلالات المعزولة عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة أسبوع.
- قم بقياس وتأكيد OD (بين 0.7 و 0.9) من أنابيب اختبار MRS سعة 7 مل لمزارع LAB المعزولة عن الألواح المخططة عند 610 نانومتر واستخدمها كمزارع عمل لجميع التجارب ذات الصلة.
- قم بإجراء تخفيفات عشرة أضعاف (مخففة بشكل متسلسل) لمزارع LAB المزروعة من أنابيب اختبار MRS النهائية سعة 7 مل باستخدام 9 مل من ماء الببتون (مخزن مؤقت فسيولوجي) للحصول على نسبة 1:10.
- أخيرا ، خذ حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من التخفيفات التسلسلية المناسبة لجميع تجارب التخمير.
- قم بتنشيط المرق الذي يحتوي على سلالات (250 ميكرولتر) من الخطوة 2.12 عن طريق نقلها إلى مرق MRS طازج سعة 7 مل واحتضانها لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
- استمر في تكرار الخطوات 2.6-2.12 لضمان نمو الخلايا القابلة للحياة والمتفوقة من مزارع LAB.
ملاحظة: تم تنشيط جميع سلالات L. bulgaricus في مرق MRS المحضر حديثا ثم تم تحضينها لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة من أجل الوصول إلى كثافة بصرية (OD610 نانومتر) من النمو البكتيري بين 0.7 و 0.9. تم قياس نمو البكتيريا باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية عند 610 نانومتر. كانت قيم الأس الهيدروجيني للمزارع الليلية في حدود 3.5 إلى 5.3 نتيجة لإنتاج حمض اللاكتيك ، وهو منتج نهائي عضوي لتخمير LAB. تم الالتزام بإجراءات السلامة مثل الدوران السليم لتدفق الهواء في غطاء السلامة البيولوجية وتجنب الحروق أثناء استخدام موقد بنسن ومراعاتها.
الشكل 1: مخطط رسومي لبروتوكول تنشيط مزارع بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB). يوفر المخطط التفاصيل والأدوات الأساسية اللازمة للتعامل مع سلالات زراعة LAB وتنشيطها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان نمو الخلايا لسلالات LAB التي تم تقييمها المزروعة ببروتوكول مراقبة الجودة مختلفا بشكل كبير (P < 0.05) عن السلالات المزروعة بدون هذا البروتوكول القياسي. استخدم بروتوكول مراقبة الجودة لكل من L. bulgaricus و L. reuteri نهجا متعدد الاستزراع الفرعي (الاستزراع الفرعي ثلاث مرات قبل أن يخط على ألواح الآجار) ، في حين أن إجراء التحكم كان يتم الاستزراع الفرعي مرة واحدة فقط مع بقاء جميع الظروف الأخرى ثابتة. كان نمو المستعمرة أيضا أعلى ومحددا جيدا على ألواح وسائط النمو التي تمت زراعتها باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة القياسي هذا. أكد هذا فعالية البروتوكول في ضمان تعزيز نمو LAB من خلال انقسام الخلايا في مرق التخمير ، وبالتالي المساعدة في تعزيز التمثيل الغذائي للخلايا في سلالات LAB. يظهر نمو سلالتين مزروعة مع وبدون بروتوكول مراقبة الجودة المطور في الشكل 2. تم وضع السلالات على ألواح أجار بعد ملاحظة وقياس النمو المكثف (0.7-0.9 عندOD 610 نانومتر). تم تحضين الصفائح لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 72 ساعة وبعد ذلك لوحظت مستعمرات منفصلة على طول خطوط الخطوط. أكدت دراسة أخرى (الشكل 3) كفاءة بروتوكول مراقبة الجودة على نمو Lactobacillus reuteri المستزرع في وسط TPY ، وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية ، حيث أكدت المستعمرات الناتجة عن تقنية بروتوكول مراقبة الجودة نموا مستقرا في الحالة المستقرة (متوسط 0.9 عندOD 610 نانومتر) بناء على البيانات التاريخية. أدت طريقة التحكم في تنشيط LAB بدون زراعة فرعية متعددة لم تستخدم تقنية مراقبة الجودة المطورة إلى نمط نمو غير متساو (0.9-0.75 عند OD610 نانومتر) من L. reuteri.
الشكل 2: التشكل الاستعماري لنمو سلالات L. bulgaricus المزروعة مع وبدون بروتوكول مراقبة الجودة المطور. تم تحميص السلالات في ثلاث نسخ وتم تحضينها لاهوائيا عند 42 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: سلوك L. reuteri على مدى فترة بعد النمو في وسط TPY عند 37 درجة مئوية باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة القياسي والطريقة التقليدية للزراعة البكتيرية (P < 0.05). تمت مراقبة نمو L. reuteri بشكل دوري لمدة شهر وتم مواءمته مع البيانات التاريخية من السنوات السابقة بناء على تنشيط الثقافة مع بروتوكول مراقبة الجودة القياسي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري لقيم OD. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كانت نتائج جميع السلالات التي تم تقييمها باستخدام بروتوكول مراقبة الجودة وبدون استخدام البروتوكول هي نفسها ، وعلى هذا النحو ، تم تقديم النتائج المرتبطة بالسلالات فقط (S9 و LB6). كان لسلالات LAB المنشطة نمو خلوي متفوق يتميز بكثافة عالية من الكتلة الحيوية للخلية ، مما تسبب في ظهور عكر لمرق MRS المخمر في أنبوب الاختبار11. كان نمو الخلايا المرصود بعد تنشيط المزرعة واضحا بين 12 ساعة و 16 ساعة عند درجة حرارة تخمر لاهوائية تبلغ 42 درجة مئوية. تم التأكيد أيضا على أن سلالات LAB التي تم تنشيطها بناء على هذا البروتوكول قد تم تحويل مورفولوجيات مستعمراتها باستمرار نتيجة لإجراء الاستزراع الفرعيالمتعدد 12 مع وجود مستعمرات منفصلة مرئية على طول خطوط الخطوط. لم تستخدم تجربة التحكم هذا البروتوكول القياسي وتم استزراعها مرة واحدة فقط. ومع ذلك ، لم يظهر أيضا تعكرا شديدا في مرق التخمير ، على الرغم من أن النمو كان لا يزال ضمن النطاق المقبول من 0.7-0.9 عندOD 610 نانومتر. ومن الجدير بالذكر أيضا أن وضع ثقافات التحكم على صفائح الآجار وحضنها لاهوائيا في ظل نفس الظروف مثل الإجراء القياسي يصور فقط مستعمرات أصغر وأقل مقارنة بتلك التي لوحظت في البروتوكول القياسي13.
يمكن أن يعزى ذلك إلى الخصائص الضعيفة وغير القابلة للحياة لخلايا LAB. وبالتالي ، فإن مفهوم سلالات LAB الفرعية الاستزراع عدة مرات وخطوط على ألواح أجار ، وبالتالي ، يؤدي إلى توليد خلايا جديدة من خلال انقسام الخلايا وتبادل المادة الوراثية في البكتيريا. هذا يعزز الوظائف الخلوية والأيضية ويعزز نمو الخلايا أثناء عمليات التخمير14. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استعادة خلايا LAB المجهدة والمصابة بناء على الحالة المستقرة لظروف النمو (المتطلبات الغذائية ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة) التي تمكنها من التكيف بسهولة واستعادة وظائف الخلية والتمثيل الغذائي الكاملة6. علاوة على ذلك ، فإن الالتزام الصارم بهذا البروتوكول يحد من تلوث مزارع الخلايا إلى حد كبير ، وبالتالي ضمان عزل مستعمرات الخلايا النقية والمتفوقة فقط لأغراض التخمير. وبالتالي ، فإن الخطوط المتكررة واستعادة مزارع خلايا LAB من ألواح أجار وفرت جدارا خلويا محسنا مناسبا تماما للأنشطة الأيضية مثل عمليات تخمير LAB15. علاوة على ذلك ، تؤكد الدراسة حول نمو L. reuteri بناء على بروتوكول مراقبة الجودة المطور (الشكل 3) كيف أن الاستزراع الفرعي LAB عبر طريقة المستعمرة إلى الاستزراع ينتج عنه نمو ثابت مستقر عند نطاق النمو الأمثل (0.9-1.0 OD 610 نانومتر) خلال فترة مقارنة بالاستزراع الفرعي مباشرة من ثقافة إلى أخرى (الطريقة التقليدية) ، مما أدى إلى نمو حاد من 0.75 إلى 0.9 عندOD 610 نانومتر . كان من الواضح أيضا أن بروتوكول مراقبة الجودة ، بمرور الوقت ، أسفر باستمرار عن نمط نمو مستقر للبكتيريا ، والذي كان له انحراف معياري (SD) يبلغ 0.1. ومع ذلك ، فإن النمو غير المتكافئ ل L. reuteri كان SD أكبر من 0.1 بسبب النمو غير المتكافئ للخلايا البكتيرية. ويعزى نمط النمو غير المتكافئ هذا ، كما سبق ذكره ، إلى الخلايا الضعيفة والمصابة. وبالتالي انخفضت وظيفة التمثيل الغذائي للخلايا خلال فترة التخمير14. تم تأكيد الدراسة الحالية أيضا من خلال دراسة سابقة أجراها أحمد وآخرون 16 حيث تم نشر L. reuteri في وسط أجار مستخلص خميرة التربتيكيس (TPY) لمدة 8 أسابيع عند 37 درجة مئوية. يعزى أحد العوامل المساهمة في النمو المطرد ل L. reuteri إلى طريقة زراعة الخلايا وتقنية مراقبة الجودة التي ولدت مزارع جديدة ونشطة بشكل فائق حتى بعد العديد من أنشطة الاستزراع الفرعي خلال فترة الدراسة.
تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول دائما استخدام مزارع تخمير جديدة وعمرها أقل من يوم واحد ودائما تحضير مرق التخمير أو وسط النمو حديثا قبل بدء التخمير ، وعدم استخدام وسيط النمو المخزن حيث تنخفض قوة وفعالية الوسط على مدى فترة طويلة من التخزين. في حالة استخدام مستنبتات المخزون من -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية ، يجب التعامل مع المزارع بشكل معقم. علاوة على ذلك ، إذا لوحظ أن مزارع المخزون ضعيفة بسبب الصدمة الباردة من الفريزر ، فإن الإنعاش مطلوب على النحو التالي. يجب تلقيح تركيزات منخفضة فقط (حوالي 100 ميكرولتر) من مزارع المخزون في مرق التخمير المكمل (MRS) بحوالي 2 مل للحضانة قبل اللاهوائية لمدة 6 ساعات تقريبا قبل إضافة MRS مكمل إضافي من حوالي 5-6 مل للحضانة اللاهوائية النهائية لحوالي 16 ساعة17. في حالة استخدام المستنبتات المجففة بالتجميد أو المجففة بالتجميد ، يوصى بشدة باستعادة الثقافات المجففة بالتجميد في 3 مل من الحليب السائل منزوع الدسم واحتضانها لاهوائيا لمدة 4-5 ساعات قبل تلقيحها في مرق التخمير المكمل مثل MRS. هذه العمليات هي المفتاح في ضمان بقاء خلية LAB في جميع الأوقات13.
خطوة أخرى حاسمة هي ضمان نمو الخلايا من الثقافات التخميرية هو دائما ضمن نطاق النمو من 0.7-0.9 ، والذي عادة ما يكون عندOD 610nm. هذا مهم لأن نطاق النمو هذا موصى به باعتباره اللوغاريتم المناسب أو المرحلة الأسية لمنحنى نمو البكتيريا17. أي قيمة كثافة بصرية (OD) أعلى من 1 ، غير دقيقة لأن هذا يؤكد أن الثقافات المخمرة قد وصلت إلى مرحلة الموت مع معظم الخلايا الميتة وتراكم النفايات الخلوية السامة الموجودة في الغالب في وسط التخمير. في حالة الوصول إلى قيمة OD أعلى من 1 (OD 610nm > 1) ، يوصى بتخفيف الثقافات 2 أو 3 أضعاف أو أكثر حتى تصل إلى قيمة OD أقل من 1 (OD610nm < 1)18. نقطة أخرى مثيرة للقلق هي احتضان الصفائح المخططة بشكل لاهوائي بشكل مناسب مع الثقافات المخمرة. على الرغم من أن معظم LAB هي اللاهوائية الاختيارية ، إلا أن النمو المعزز محدود في وجود الأكسجين. ومن ثم فإن تفضيل الظروف اللاهوائية مطلوب لتعزيز النمو الفعال. يوصى باستخدام غرفة CO 2 أو وعاء مرتجل يمكن أن يولد CO2 خلال فترة الحضانة عند 42 درجة مئوية. للحصول على أفضل نتائج نمو الخلايا على الألواح المحتضنة ، يوصى باستخدام 72 ساعة للحصول على أفضل النتائج18.
ومع ذلك ، لا توجد قيود على هذا الإجراء القياسي ، لأن الالتزام الصارم بالخطوات سيضمن خلايا LAB قابلة للحياة ونقية لإجراءات التخمير. تعتمد أهمية هذا البروتوكول القياسي على نهجه الاستباقي لضمان بقاء خلايا البروبيوتيك ، خاصة بالنسبة للمزارع التخميرية. وهي بمثابة آلية لمراقبة الجودة تسعى إلى القضاء على التلوث وتعزيز الثقافات القوية والقابلة للحياة للغاية والتي يمكن أن تنتج غلات مرغوبة من التخمير في ظل الظروف القياسية. بالإشارة إلى الطرق الحالية أو التقليدية ، يلغي هذا البروتوكول القياسي فرصة تحديات بقاء خلايا LAB (بسبب الصدمة الباردة ، وضعف متوسط النمو) كما يسعى إلى ضمان المفهوم الصحيح لأول مرة المتمثل في وجود مزارع بروبيوتيك نقية وقابلة للحياة ، ويوفر الوقت ، ويعزز الإنتاجية عند العمل مع ثقافات LAB.
التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية هائلة ، حيث يمكن استخدام هذا البروتوكول في كل من مختبرات الأبحاث وصناعات الألبان والأغذية والمعالجة الحيوية والتخمير ومعاهد التكنولوجيا الحيوية. وتستند الميزة الإضافية لهذا البروتوكول إلى طبيعته التبسيطية وبالتالي لا يتطلب استخداما متطورا لمعدات المختبرات. على هذا النحو ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتعلم التوضيحي أو التربوي في المدارس الثانوية التي لديها بيئة معملية أساسية لتشجيع وبناء اهتمام الطلاب في المجالات ذات الصلة بالعلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (STEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
أصبح هذا المنشور ممكنا بفضل المنحة رقم NC. X-267-5-12-170-1 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة (NIFA) وجزئيا من قبل NIZO Food Research BV ، هولندا ، Jarrow Formulas ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وقسم علوم الأسرة والمستهلك ومحطة البحوث الزراعية في جامعة ولاية كارولينا الشمالية للزراعة والتقنية (جرينسبورو ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية 27411). تم دعم هذا العمل أيضا ، جزئيا ، من خلال منحة برنامج بناء القدرات لعام 1890 رقم (2020-38821-31113 / مشروع الانضمام رقم 021765). كما تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل وزارة التعليم والعلوم البلغارية في إطار برنامج البحث الوطني "أغذية صحية لاقتصاد حيوي قوي ونوعية حياة" الذي تمت الموافقة عليه من قبل DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
