Summary
乳酸菌(LAB)培養物の品質管理評価は、発酵手順のためのLAB株の生存率と機能性を高める効果的な方法として確認されています。この主張を裏付けるために、LAB培養物がどのように活性化され、発酵およびバイオプロセシング手順のために培養されるかを解明するプロトコルを開発しました。
Abstract
乳酸菌(LAB)は、ヨーグルトやチーズなどの発酵乳製品の製造に大きく採用されている必須の乳製品スターター培養物です。LABは主に発酵の主要な最終産物として乳酸を生産し、発酵食品の官能特性を付与する重要な代謝産物を合成します。LABは、適切な栄養要件が満たされると多くの環境で繁殖する潔癖な細菌です。食品および乳製品業界での発酵用途向けの優れたLAB乳製品スターター培養の需要により、すべてのバイオプロセシング操作に実行可能で活性な培養を提供する必要が生じています。したがって、実験室および乳製品加工環境でのLAB培養の実行可能性と強化された機能を確保するための標準プロトコルの開発は非常に重要です。弱く、ストレスを受け、損傷したLAB培養細胞の蘇生に関連する懸念に対処する上で、LAB株の回復、細胞再生の促進、代謝機能の改善のための顕著なステップを鮮明に概説するプロトコルが最も重要です。LABスターター培養の培養純度、機能性、生存率の維持も同様に重要です。したがって、独自のプロトコルガイドラインを順守することで、発酵およびバイオテクノロジープロセスに特化した多くのLAB株の発酵性能が促進されます。その結果、ノースカロライナ農業技術州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所は、選択されたLAB株の活性化と品質管理のための標準プロトコルを開発し、発酵研究に使用される高機能で実行可能なLAB培養株をもたらしました。このようなプロトコルを乳製品および食品業界で使用するための適応と推奨は、多くのアプリケーションでLABの実行可能性と機能を確保するのに役立ちます。
Introduction
乳酸菌(LAB)は、産業の可能性を秘めたユニークで多様な細菌のグループです。ラクトバチルス・デルブレウッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスに属する株は、主にヨーグルト1などの発酵乳製品の乳製品スターター培養物として使用されます。選択されたLAB株は、投与量が適切に投与された場合に人間に健康上の利点を与えるため、プロバイオティクスとしても分類されます2。乳酸菌はまた、グラム陽性、非芽胞形成、非呼吸性であるが好気性微生物であり、一般に重要な発酵産物としての乳酸の生産によって特徴付けられる。LABはまた、必須代謝物、例えば有機酸、バクテリオシン、および広範囲の食品媒介病原体を阻害することができる他の抗菌化合物3を合成する4。炭水化物異化の主要な最終産物であり、LAB発酵の副産物である乳酸は、抗菌特性を有する有機代謝産物であり、食品の生物保存用途に潜在的に有用である3,5,6。さらに、LABによって生成された有機酸は、食品の風味、食感、および香りを与え、その結果、それらの全体的な官能特性を高めます5,6。LABの明確な栄養要件とそのユビキタスな性質が相まって、最終的には、乳製品ベースの食品、発酵食品、野菜、および人間の腸などのさまざまな環境で細菌が容易に繁殖することを可能にします7。
ヨーグルト生産および多くの多様な乳製品用途のためのLABからのスターター培養に対する需要が高まっています8,9したがって、この活性は発酵性能の向上に不可欠であるため、LAB株の栽培、および凍結乾燥株と単離株の両方の活性化において、重要な注意と確立された科学的技術を順守する必要があります。食品微生物学・バイオテクノロジー研究室では、発酵乳製品やヨーグルト製造に使用される工業用スターター培養物から分離されたLAB株の特性である活性化、優れた増殖、発酵に向けた適切な技術開発に積極的に取り組んでいます。さらに、工業的に生産されたLAB培養株は、凍結乾燥や凍結保存などの保存活性を受け、コールドショックプロセスの結果として細胞ストレスや損傷を引き起こすことは注目に値します10。単離された食品または凍結乾燥製品のいずれかから得られるLAB株の生存率の課題および機能性の改善を制限するには、それらの発酵特性を高めるための品質管理の一形態としてこれらの培養物を適切に活性化することが重要です8。本研究では、L. delbrueckii subsp. bulgaricus培養株の活性化と増殖のための社内品質管理プロトコルを開発し、最終的にLAB株の増殖を促進し、LAB株の発酵性能と代謝機能を向上させることを目的としています。このプロトコルは、最終的には(最適な増殖培地と適切な培養条件を使用して)発酵研究のための他のLAB株の培養、ならびに産業目的またはバイオプロセシング操作に適合させることができます。したがって、このLAB活性化および品質管理プロトコルにより、優れた実行可能な乳製品スターター培養が得られ、世界の乳製品および食品業界の多様なアプリケーションで機能する可能性があります。
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Protocol
1.一般的な材料と方法
- ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの供給源
- 信頼できる情報源から L.ブルガリカス 株を入手してください。
注:この研究では、合計5つの L.ブルガリカス 株が品質管理研究で使用されました(表1)。発酵乳製品の工業生産のための凍結乾燥 L.ブルガリカス の2つの株は、ブルガリアのプロブディフにある食品技術大学のバイオテクノロジー学部のアルバートクラスタノフ博士によって提供されました。米国市場で入手可能な市販のヨーグルト製品から分離された2つの菌株は、ノースカロライナA&T州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所の-80°Cのストックから入手し、1つの凍結乾燥株はベンダーCから供給されました。全てのLAB株は、さらなる使用まで-80°Cに保たれた。ノースカロライナA&T州立大学の食品微生物学およびバイオテクノロジー研究所の-80°Cストックから得られた別の細菌株(Limosilactobacillus reuteri)も評価した。
- 信頼できる情報源から L.ブルガリカス 株を入手してください。
- 標準L.MRS発酵ブロス培地
- 55 gのMRSと0.5 gのL-システインを1 Lの脱イオン水(DW)に完全に溶解して、デマン、ロゴサシャープ(MRS)培地を調製します。
- 調製したMRS溶液7 mLと2 mLをそれぞれ試験管に分注し、オートクレーブを121°Cで15分間分注した後、室温(RT)で冷却します。
- MRS寒天培地
- MRS55gおよびL-システイン0.5gを1LのDWに完全に溶解してMRS寒天培地を調製する。寒天粉末(15g)を加え、寒天培地を121°Cで15分間殺菌した後、水浴中で冷却する。
- 調製したてのすべての培地を滅菌ペトリ皿に注ぎ、さらに必要になるまで4°Cで保管します。
- 修飾強化クロストリジウム培地ピルビン酸(mRCM-PYR)
- Oyeniran et al.13およびNwamaiohaおよびIbrahim18に従って強化クロストリジウム培地を最適化し、10 gのペプトン#3、10 gの牛肉抽出物、5 gの酵母エキス、5 gの塩化ナトリウム、3 gの酢酸ナトリウム、2 gのリン酸二カリウムを溶解することにより、L.ブルガリカスの選択性と正確な列挙を実現します。 1リットルのDW中に0.1gのウラシル、0.25gの塩化カルシウム、5gのデキストロース、5gのフルクトース、10gのマルトース、2gのピルビン酸ナトリウム、0.2%トゥイーン80、および0.5gのL-システイン。
- 0.008%アニリンブルーと15 gの寒天を添加する前に、6 N HClを使用して溶液の最終pH(6.0 ± 0.2)を調整します。培地を121°Cで15分間オートクレーブし、水浴中で冷却し、滅菌ペトリ皿に注ぎます。新しく調製したすべての培地を、必要になるまで4°Cの滅菌ペトリ皿に保管します。
- LAB培養のグリセロールストック
- 100%グリセロールを同量のDWで希釈してグリセロールストック(50%グリセロール)を調製し、乾式滅菌サイクルを使用して100°Cで30分間滅菌します。グリセロールストックをRTまで冷却し、さらに使用するために無菌的に保管します。
- 一晩の培養からの細菌増殖(開発されたQCプロトコルを使用して得られた L.ブルガリカス の単一コロニー)を使用します。
- 500 μLの一晩培養液を2 mLの遠沈管で50%グリセロールにピペットで入れ、穏やかに混ぜ合わせます。LAB培養物を含むグリセロールストックを凍結し、必要になるまで-80°Cの超低温で保管します。
注: LAB培養の品質管理と活性化のためのプロトコルのグラフィカルスキームを 図1に示します。
| いいえ | 製品コード | 見本 | 源 | ラベル1の細菌組成 |
| 1 | S9 | 純粋な産業ひずみ | ブルガリア | ポンドブルガリカス |
| 2 | ポンド6 | 純粋な産業ひずみ | ブルガリア | ブルガリカス、 |
| 3 | ATCC 11842 | 純粋な産業ひずみ | ティッカー | ポンドブルガリカス |
| 4 | ダウ | ヨーグルト | 米国 | ブルガリカス、その他の生きた文化 |
| 5 | E22 | ヨーグルト | 米国 | ブルガリカス、その他の生きた文化 |
| 6 | ロイテリ | ヨーグルト | 米国 | リモシラクトバチルス・ロイテリ |
| 1ポンド=ラクトバチルス | ||||
表1:プロバイオティクス株。 この表は、この研究で使用されたプロバイオティクス株を示しています。
2. LAB培養の活性化と品質管理のためのプロトコル
- 調製したLAB株のグリセロールストック(2 mL遠沈管)を-80°Cの超低冷凍庫から取り出し、使用前に解凍させないでください。
- 遠心分離管の開口部を70%アルコールで洗浄して消毒し、使用前に穏やかにボルテックスします。
- 約250 μL(0.25 mL)のストックLAB培養液を遠心チューブから新鮮な2 mL MRS試験管にピペットで入れます。
- 穏やかにボルテックスし、試験管をパラフィルム化し、42°Cで12〜16時間一晩嫌気的にインキュベートします。
- 2 mL MRS試験管から一晩培養した培養物から約500 μL(0.5 mL)を新鮮な7 mL MRS試験管、ボルテックスに取り、42°Cで12〜16時間嫌気的にインキュベートします。
- UV-可視分光光度計で610 nmでの培養物の光学密度(OD)または増殖を測定し、0.7〜0.9の許容結果を記録することにより、微生物の増殖を評価します。
- 7 mL MRSチューブからMRSおよびMRCM-PYR寒天プレートに一晩培養物をストリークし、42°Cで72時間嫌気的にインキュベートします。
- 寒天プレートから単離されたコロニーを選び、新鮮な7 mL MRS試験管に移し、穏やかにボルテックスし、42°Cで12〜16時間一晩嫌気的にインキュベートします。
- 単離した菌株を含む寒天プレートを冷蔵庫で4°Cで1週間保存する。
- 610 nmのストリークプレートから分離されたLAB培養の7 mL MRS試験管からのOD(0.7〜0.9)を測定および確認し、関連するすべての実験の作業培養物として使用します。
- 9 mLのペプトン水(生理的バッファー)を使用して、最終的な7 mL MRS試験管から増殖したLAB培養液を10倍希釈(段階希釈)し、1:10の比率を得ました。
- 最後に、すべての発酵実験に適した段階希釈液から約250 μL(0.25 mL)を取ります。
- ステップ2.12の菌株(250 μL)を含むブロスを新鮮な7 mL MRSブロスに移し、42°Cで16時間嫌気的にインキュベートすることにより活性化します。
- ステップ2.6〜2.12を繰り返して、LAB培養からの生存可能で優れた細胞増殖を確保します。
注:すべての L.ブルガリカス 株は、新たに調製したMRSブロスで活性化され、次に42°Cで16時間嫌気的にインキュベートされ、0.7〜0.9の細菌増殖の光学密度(OD610 nm)に達しました。細菌の増殖は、610nmの紫外可視分光光度計で測定した。一晩培養のpH値は、LAB発酵の有機最終産物である乳酸の生産の結果として3.5〜5.3の範囲でした。バイオセーフティフード内の適切な気流循環やブンゼンバーナーの使用中の火傷の回避などの安全手順が順守され、観察されました。
図1:乳酸菌(LAB)培養の活性化のためのプロトコルのグラフィカルスキーム。 このスキームは、LAB培養株の取り扱いと活性化に必要な詳細と基本的な機器を提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
品質管理プロトコルで培養した評価されたLAB株の細胞増殖は、この標準プロトコルなしで培養した株とは有意に異なっていた(P < 0.05)。L. bulgaricusとL. reuteriのQCプロトコルは、マルチ継代培養アプローチ(寒天プレート上でストリーキングする前に3回継代培養する)を採用しましたが、対照手順では、他のすべての条件を一定に保ちながら継代培養を1回だけ行いました。コロニーの成長も高く、この標準QCプロトコルを使用して培養された成長培地プレートで明確に定義されていました。これにより、発酵ブロスでの細胞分裂を通じてLAB増殖の促進を確実にするプロトコルの有効性が確認され、したがって、LAB株の細胞代謝の増強が促進されました。開発された品質管理プロトコルの有無にかかわらず培養された2つの株の増殖を図2に示します。株は、激しい成長(OD610 nmで0.7〜0.9)が観察され、測定された後、寒天プレート上にストリークされました。プレートを42°Cで72時間嫌気的にインキュベートした後、ストリーキング線に沿って個別のコロニーが観察されました。別の研究(図3)では、TPY培地で培養したラクトバチルス・ロイテリの増殖に対する品質管理プロトコルの効率を確認し、37°Cでインキュベートし、QCプロトコル技術によって生成されたコロニーは、履歴データに基づいて安定した定常状態の成長(OD610 nmで平均0.9)を確認しました。開発したQC技術を用いない複数回継代培養を伴わないLAB活性化の制御法では、L. reuteriの増殖パターンが不均一(OD610 nmで0.9-0.75)した。
図2:開発された品質管理プロトコルの有無にかかわらず栽培された L.ブルガリカス 株の生育の植民地形態。菌株を三重にストリークし、42°Cで72時間嫌気的にインキュベートしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Lの挙動。標準化されたQCプロトコルおよび従来の細菌培養法を用いてTPY培地で増殖した後の期間にわたってロイテリ(P < 0.05)。 L. reuteriの増殖は1ヶ月間定期的に監視され、標準QCプロトコルによる培養活性化に基づいて、前年の履歴データと一致しました。エラーバーはOD値の標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
品質管理プロトコルを使用した場合と使用しない場合で評価されたすべての菌株の結果は同じであり、そのため、菌株(S9、およびLB6)のみにリンクした結果が提示されました。活性化されたLAB株は、高強度の細胞バイオマスを特徴とする優れた細胞増殖を有し、したがって、試験管11内のMRS発酵ブロスの濁った外観を引き起こした。培養活性化後に観察された細胞増殖は、嫌気性発酵温度42°Cで12時間から16時間の間に明らかでした。 また、このプロトコルに基づいて活性化されたLAB株は、マルチ継代培養手順12 の結果としてコロニー形態が継続的に変化し、ストリーキングの線に沿って個別のコロニーが見えることも確認されました。対照実験はこの標準プロトコルを使用せず、継代培養は1回だけ行った。しかしながら、それは発酵ブロス中にも強い濁度を示さなかったが、成長はOD610nmで0.7〜0.9の許容範囲内であった。また、寒天プレート上で対照培養物をストリーキングし、標準手順と同じ条件下で嫌気的にインキュベートすると、標準プロトコル13で観察されたものと比較して、コロニーが小さく、少なくなるだけであったことも注目に値する。
これは、LAB細胞の弱くて生存不可能な特性に起因する可能性があります。その結果、LAB株を複数回継代培養し、寒天プレート上でストリーキングするという概念は、細菌の細胞分裂と遺伝物質の交換を通じて新しい細胞の生成をもたらします。これは、細胞および代謝機能を高め、発酵操作中の細胞の成長を促進する14。さらに、ストレスや損傷を受けたLAB細胞も、成長条件(栄養要件、pH、温度)の定常状態に基づいて回収されるため、細胞および代謝機能に容易に適応して完全な機能を取り戻すことができます6。さらに、このプロトコルを厳守することで、細胞培養物の汚染が大幅に制限され、純粋で優れた細胞コロニーのみが発酵目的で分離されます。したがって、寒天プレートからのLAB細胞培養物のストリーキングと回収を繰り返し行うことで、LAB発酵操作などの代謝活動に適した細胞壁が強化されました15。さらに、開発した品質管理プロトコル(図3)に基づくL. reuteriの増殖に関する研究では、コロニーから培養法によるLABの継代培養は、培養から培養への直接継代培養(従来法)と比較して、最適な増殖範囲(0.9-1.0 OD 610 nm)で安定した安定した増殖をもたらし、OD610 nmで0.75から0.9に急激に増殖することを確認しました。.また、QCプロトコルは、時間の経過とともに、標準偏差(SD)が0.1の安定した細菌増殖パターンを一貫してもたらすことも明らかでした。しかし、L. reuteriの不均一な増殖は、細菌細胞の不均一な増殖のために、そのSDが0.1を超えていた。すでに述べたように、この不均一な成長パターンは、弱くて損傷した細胞に起因していました。したがって細胞の代謝機能は発酵期間14の間に低下した。現在の研究は、Ahmedらによる以前の研究によっても確認されました16それによって、彼らの研究では、L. reuteriはトリプチカーゼペプトン酵母エキス(TPY)寒天培地中で37°Cで8週間増殖しました。 L. reuteriの着実な増殖に寄与する要因は、研究期間中に数回の継代培養活動を行った後でも、新しく優れた活性培養を生成する細胞培養方法と品質管理技術に起因していました。
このプロトコルの重要なステップには、常に新しくて1日未満の発酵培養物を採用し、発酵開始前に常に発酵ブロスまたは成長培地を新しく調製すること、および培地の強度と効力が長期間にわたって低下するため、保存された増殖培地を使用しないことが含まれます。-80°Cまたは-20°Cのいずれかのストック培養を使用する場合は、培養物を無菌的に処理する必要があります。さらに、冷凍庫からのコールドショックによりストックカルチャーが弱いことが観察された場合は、次のように蘇生が必要です。低濃度(約100 μL)のストック培養のみを、約2 mLの補充発酵ブロス(MRS)に接種して約6時間前嫌気性インキュベーションを行い、その後、約5〜6 mLの追加の補充MRSを約16時間17時間加える必要があります。凍結乾燥または凍結乾燥培養物を使用する場合は、凍結乾燥培養物を3 mLのスキム液体ミルクで回収し、嫌気的に約4〜5時間インキュベートしてから、MRSなどの補充発酵ブロスに接種することを強くお勧めします。これらのプロセスは、LAB細胞の生存率を常に確保するための鍵となります13。
別の重要なステップは、発酵培養物の細胞増殖が常に0.7〜0.9の増殖範囲内にあり、通常はOD610nmであることを保証することである。 これは、増殖範囲が細菌増殖曲線17の適切な対数または指数位相として推奨されるので重要である。1を超える光学密度(OD)値は、発酵培養物が死期に達し、ほとんどの死細胞と主に発酵培地に存在する有毒な細胞廃棄物の蓄積が確認されるため、不正確です。OD値が1を超える場合(OD610nm > 1)18.未満のOD値に達するまで、培養物を2倍または3倍以上に希釈することをお勧めします(OD610nm < 1)18。もう一つの懸念事項は、縞模様のプレートを発酵培養物と適切に嫌気的にインキュベートすることです。ほとんどのLABは通性嫌気性菌ですが、酸素の存在下では成長の促進は制限されます。したがって、効率的な成長を促進するには、嫌気性条件の好みが必要です。42°Cでのインキュベーション期間中にCO2を発生する可能性のあるCO2チャンバーまたは即席容器を使用することをお勧めします。 インキュベートしたプレート上で最良の細胞増殖結果を得るには、最適な結果を得るために72時間が推奨されます18。
ただし、この標準的な手順を厳守することで、発酵手順のための生存可能で純粋なLAB細胞が保証されるため、この標準的な手順に制限はありません。この標準プロトコルの重要性は、特に発酵培養において、プロバイオティクス細胞の生存率を確保するための積極的なアプローチに基づいています。これは、汚染を排除し、最終的には標準条件下で望ましい発酵収量を生み出すことができる強力で実行性の高い培養を促進することを目指す品質管理メカニズムとして機能します。既存または従来の方法を参照して、この標準プロトコルは、LAB細胞の生存率の課題(コールドショック、および不十分な増殖培地による)の可能性を排除し、純粋で実行可能なプロバイオティクス培養を行うという初回の正しい概念を保証し、時間を節約し、LAB培養で作業する際の生産性を促進することも目指しています。
このプロトコルは、研究所、乳製品および食品産業、バイオプロセシング、発酵、およびバイオテクノロジー機関の両方で使用できるため、この技術の将来の用途は非常に大きいです。このプロトコルの追加の利点は、その単純な性質に基づいているため、実験装置の高度な使用を必要としません。そのため、このプロトコルは、科学、技術、工学、数学(STEM)関連分野への学生の関心を奨励および構築するための基本的な実験室環境を備えた高校でのデモンストレーションまたは教育学習に使用できます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この出版物は、助成金番号NCによって可能になりました。X-267-5-12-170-1は、国立食糧農業研究所(NIFA)から、一部はNIZO Food Research BV、オランダ、Jarrow Formulas、米国、ノースカロライナ農業技術州立大学(グリーンズボロ、ノースカロライナ州、米国27411)の家族消費者科学部および農業研究ステーションによるものです。この作業は、1890年のキャパシティビルディングプログラム助成金番号(2020-38821-31113 /プロジェクトアクセッション番号021765)によっても部分的にサポートされました。この作業は、DCM#577 / 17.08.2018によって承認された国家研究プログラム「強力なバイオエコノミーと生活の質のための健康食品」の下でブルガリア教育科学省によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
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