Summary
Kvalitetskontrollbedömningen av mjölksyrabakterier (LAB) kulturer har bekräftats som ett effektivt sätt att förbättra livskraften och funktionaliteten hos LAB-stammar för jäsningsprocedurer. För att stödja detta påstående utvecklade vi ett protokoll som belyser hur LAB-kulturer aktiveras och odlas för jäsning och bioprocessningsprocedurer.
Abstract
Mjölksyrabakterier (LAB) är viktiga mjölkstartkulturer som används avsevärt för tillverkning av fermenterade mejeriprodukter som yoghurt och ost. LAB producerar övervägande mjölksyra som en viktig slutprodukt av jäsning, och de syntetiserar viktiga metaboliter som ger de organoleptiska egenskaperna hos fermenterade livsmedelsprodukter. LAB är krångliga bakterier som trivs i många miljöer när tillräckliga näringsbehov är uppfyllda. Efterfrågan på överlägsna LAB-mjölkstartkulturer för jäsningstillämpningar inom livsmedels- och mejeriindustrin har resulterat i behovet av att tillhandahålla livskraftiga och aktiva kulturer för all bioprocessning. Utvecklingen av ett standardprotokoll för att säkerställa livskraften och förbättrad funktionalitet hos LAB-kulturer i laboratoriet såväl som mejeribearbetningsmiljöer är därför mycket kritisk. För att ta itu med problem kopplade till återupplivning av svaga, stressade och skadade LAB-odlingsceller är ett protokoll som levande beskriver framträdande steg för att återhämta sig, förbättra cellregenerering och förbättra metabolisk funktionalitet hos LAB-stammar av yttersta vikt. Upprätthållandet av kulturens renhet, funktionalitet och livskraft för LAB-startkulturer är också avgörande. Därför kommer efterlevnad av en unik protokollriktlinje att resultera i främjande av jäsningsprestanda för många LAB-stammar som är avsedda för jäsning och bioteknikprocesser. Som ett resultat har Food Microbiology and Biotechnology Laboratory vid North Carolina Agriculture and Technical State University utvecklat ett standardprotokoll för aktivering och kvalitetskontroll av utvalda LAB-stammar som har resulterat i mycket funktionella och livskraftiga LAB-kulturstammar som används för jäsningsforskning. Anpassningen och rekommendationen av ett protokoll som detta för användning inom mejeri- och livsmedelsindustrin kommer att bidra till att säkerställa LAB-livskraft och funktionalitet för många applikationer.
Introduction
Mjölksyrabakterier (LAB) är en grupp unikt olika bakterier som har industriell potential. Stammar som tillhör Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus och Streptococcus thermophilus används mest som mejeristarter kulturer för fermenterade mejeriprodukter såsom yoghurt1. Utvalda LAB stammar klassificeras också som probiotika eftersom de ger hälsofördelar för människor när doser administreras på ett adekvat sätt2. Mjölksyrabakterier är också grampositiva, icke-sporbildande, icke-respirerande men aerotoleranta mikroorganismer som i allmänhet kännetecknas av produktion av mjölksyra som en viktig jäsningsprodukt. LAB syntetiserar också väsentliga metaboliter, till exempel organiska syror, bakteriociner och andra antimikrobiella föreningar3 som kan hämma ett brett spektrum av livsmedelsburna patogener4. Mjölksyra, en viktig slutprodukt av kolhydratkatabolism och en biprodukt av LAB-jäsning, är en organisk metabolit som har antimikrobiella egenskaper och är potentiellt användbar för biokonserveringsapplikationer för livsmedel 3,5,6. Dessutom ger de organiska syrorna som produceras av LAB smak, konsistens och arom av livsmedel, vilket följaktligen förbättrar deras totala organoleptiska egenskaper 5,6. De distinkta näringsbehoven hos LAB i kombination med deras allestädes närvarande natur gör det i slutändan möjligt för bakterierna att lätt trivas i olika miljöer som mejeribaserade livsmedel, fermenterade livsmedel, grönsaker såväl som i människans tarm7.
Det finns en växande efterfrågan på startkulturer från LAB för yoghurtproduktion och många olika mejeriapplikationer8,9, därför bör kritisk uppmärksamhet och etablerade vetenskapliga tekniker följas, i LAB-stammar odling, liksom vid aktivering av både frystorkade och isolerade stammar eftersom denna aktivitet är avgörande för förbättrad jäsningsprestanda. Laboratoriet för livsmedelsmikrobiologi och bioteknik engagerar sig därför aktivt i lämplig teknikutveckling inriktad på aktivering, överlägsen tillväxt och jäsning som är karakteristisk för LAB-stammar isolerade från fermenterade mejeriprodukter samt från industriella startkulturer som används för yoghurtproduktion. Dessutom är det anmärkningsvärt att LAB-odlingsstammar som produceras industriellt genomgår konserveringsaktiviteter såsom frystorkning och frusen lagring, vilket orsakar cellstress och skada, som ett resultat av den kalla chockprocessen som de utsätts för10. För att begränsa, livskraften utmaningar och förbättra funktionaliteten hos LAB-stammar som erhålls från antingen isolerade livsmedelsprodukter eller frystorkade produkter, är det viktigt att korrekt aktivera dessa kulturer som en form av kvalitetskontroll för att förbättra deras fermentativa egenskap8. I denna studie var målet att utveckla ett internt kvalitetskontrollprotokoll för aktivering och tillväxt av L. delbrueckii subsp. bulgaricus kulturstammar som i slutändan främjade livskraftig LAB-tillväxt, samt förbättrade jäsningsprestandan och den metaboliska funktionaliteten hos LAB-stammar. Detta protokoll kan i slutändan anpassas (med hjälp av optimala tillväxtmedier och lämpliga odlingsförhållanden) för odling av andra LAB-stammar för jäsningsforskning, såväl som för industriella ändamål eller biobearbetningsoperationer. Detta LAB-aktiverings- och kvalitetskontrollprotokoll kommer därför att säkerställa att överlägsna livskraftiga mjölkstartkulturer erhålls och potentiellt fungerar för olika applikationer inom den globala mejeri- och livsmedelsindustrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänna material och metoder
- Källa till Lactobacillus delbrueckii subsp .
- Skaffa L. bulgaricus stammar från tillförlitliga källor.
OBS: I denna studie användes totalt fem (5) L. bulgaricus-stammar i kvalitetskontrollstudien (tabell 1). Två stammar av frystorkad L. bulgaricus för industriell produktion av fermenterade mjölkprodukter tillhandahölls av Dr. Albert Krastanov, Institutionen för bioteknik vid University of Food Technologies, Plovdiv, Bulgarien. Två stammar isolerade från kommersiella yoghurtprodukter som finns tillgängliga på den amerikanska marknaden erhölls från -80 ° C lager av Food Microbiology and Biotechnology laboratorium vid North Carolina A&T State University och en frystorkad stam levererades av en leverantör C. Alla LAB-stammar hölls vid -80 °C tills vidare användning. En annan bakteriestam (Limosilactobacillus reuteri) erhölls från -80 ° C lager av Food Microbiology and Biotechnology laboratoriet vid North Carolina A&T State University utvärderades också.
- Skaffa L. bulgaricus stammar från tillförlitliga källor.
- Standard L. MRS-jäsningsbuljongmedium
- Förbered deMan, Rogosa Sharpe (MRS) medium genom att helt lösa 55 g MRS och 0,5 g L-cystein i 1 liter avjoniserat vatten (DW).
- Fördela 7 ml och 2 ml av den beredda MRS-lösningen i provrör, autoklav vid 121 °C i 15 minuter och svalna sedan vid rumstemperatur (RT).
- MRS agar medium
- Bered MRS-agarmedium genom att helt lösa 55 g MRS och 0,5 g L-cystein i 1 liter DW. Tillsätt agarpulver (15 g), sterilisera agarmediet vid 121 °C i 15 min och kyl det sedan i ett vattenbad.
- Häll alla nyberedda medier i sterila petriskålar och förvara dem vid 4 °C tills de behövs.
- Modifierad förstärkt klostridial mediumpyruvat (mRCM-PYR)
- Optimera ett förstärkt klostridialmedium enligt Oyeniran et al.13 och Nwamaioha och Ibrahim18, för selektivitet och noggrann uppräkning av L. bulgaricus genom att lösa 10 g pepton #3, 10 g nötköttsextrakt, 5 g jästextrakt, 5 g natriumklorid, 3 g natriumacetat, 2 g kaliumfosfatdibasisk, 0,1 g uracil, 0,25 g kalciumklorid, 5 g dextros, 5 g fruktos, 10 g maltos, 2 g natriumpyruvat, 0,2% Tween 80 och 0,5 g L-cystein i 1 liter DW.
- Justera det slutliga pH-värdet (6,0 ± 0,2) i lösningen med 6 N HCl före tillsats av 0,008% anilinblått och 15 g agar. Autoklavera mediet vid 121 °C i 15 minuter, svalna i ett vattenbad och häll i sterila petriskålar. Förvara alla nyberedda medier i sterila petriskålar vid 4 °C tills det behövs.
- Glycerollager av LAB-kulturer
- Bered glycerollager (50% glycerol) genom att späda 100% glycerol i samma volym DW och sterilisera vid 100 ° C i 30 minuter med en torr steriliseringscykel. Kyl glycerollagren till RT och förvara dem aseptiskt för vidare användning.
- Använd bakterietillväxt (en enda koloni av L. bulgaricus erhållen med hjälp av det utvecklade QC-protokollet) från över natten kulturer.
- Pipettera 500 μl av nattkulturerna till 50% glycerol i ett 2 ml centrifugrör och blanda dem försiktigt. Frys och förvara glycerolbuljongen som innehåller LAB-kulturerna vid en extremt låg temperatur på -80 °C tills det behövs.
OBS: Ett grafiskt schema för protokollet för kvalitetskontroll och aktivering av LAB-kulturer visas i figur 1.
| Nej | Produkt kod | Prov | Källa | Bakteriell sammansättning som märkt1 |
| 1 | S9 | Ren industriell belastning | Bulgarien | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | Ren industriell belastning | Bulgarien | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | Ren industriell belastning | ATCC | Lb. bulgaricus |
| 4 | KAJA | Yoghurt | USA | Lb. bulgaricus, annan levande kultur |
| 5 | E22 | Yoghurt | USA | Lb. bulgaricus, annan levande kultur |
| 6 | Reuteri | Yoghurt | USA | Limosilactobacillus reuteri |
| 1lb. =Lactobacillus | ||||
Tabell 1: Probiotiska stammar. Tabellen listar de probiotiska stammar som används i denna studie.
2. Protokoll för aktivering och kvalitetskontroll av LAB-kulturer
- Ta det beredda glycerollagret av LAB-stammar (i 2 ml centrifugrör) från den ultralåga frysen -80 °C och låt dem inte tina före användning.
- Rengör och desinficera öppningen av centrifugrören med 70% alkohol och virvla försiktigt före användning.
- Pipettera cirka 250 μL (0,25 ml) av lager-LAB-kulturen från centrifugrören till färska 2 ml MRS-provrör.
- Virvla försiktigt, parafilma provrören och inkubera dem anaerobt över natten vid 42 °C i 12-16 timmar.
- Ta cirka 500 μL (0,5 ml) från de odlade kulturerna över natten från 2 ml MRS-provrören till färska 7 ml MRS-provrör, virvel och inkubera dem anaerobt över natten vid 42 ° C i 12-16 timmar.
- Bedöm den mikrobiella tillväxten genom att mäta den optiska densiteten (OD) eller tillväxten av kulturerna vid 610 nm med en UV-synlig spektrofotometer och registrera acceptabla resultat mellan 0,7 och 0,9.
- Stryk över nattkulturerna från 7 ml MRS-rören på MRS- och MRCM-PYR-agarplattorna och inkubera dem anaerobt i 72 timmar vid 42 °C.
- Välj isolerade kolonier från agarplattorna, överför dem till färska 7 ml MRS-provrör, virvla försiktigt och inkubera dem anaerobt över natten vid 42 ° C i 12-16 timmar.
- Förvara agarplattorna som innehåller de isolerade stammarna vid 4 °C i kylskåp i en vecka.
- Mät och bekräfta OD (mellan 0,7 och 0,9) från 7 ml MRS-provrören i LAB-kulturerna isolerade från de streckade plattorna vid 610 nm och använd dem som arbetskulturer för alla relaterade experiment.
- Utför tiofaldiga utspädningar (seriellt utspädda) av de odlade LAB-kulturerna från de slutliga 7 ml MRS-provrören med 9 ml peptonvatten (en fysiologisk buffert) för att erhålla ett förhållande 1:10.
- Ta slutligen cirka 250 μl (0,25 ml) från lämpliga serieutspädningar för alla jäsningsexperiment.
- Aktivera buljongen som innehåller stammar (250 μl) från steg 2.12 genom att överföra dem till färsk 7 ml MRS-buljong och inkubera dem anaerobt vid 42 °C i 16 timmar.
- Fortsätt genom att upprepa steg 2.6-2.12 för att säkerställa livskraftig och överlägsen celltillväxt från LAB-kulturer.
OBS: Alla L. bulgaricus-stammar aktiverades i den nyberedda MRS-buljongen och inkuberades sedan anaerobt vid 42 °C i 16 timmar för att nå en optisk densitet (OD610 nm) av bakterietillväxt mellan 0,7 och 0,9. Bakterietillväxt mättes med en UV-synlig spektrofotometer vid 610 nm. pH-värdena för nattkulturerna låg i intervallet 3,5 till 5,3 som ett resultat av produktionen av mjölksyra, en organisk slutprodukt av LAB-jäsning. Säkerhetsprocedurer som korrekt luftflödescirkulation i biosäkerhetshuven och undvikande av brännskador under användning av bunsenbrännaren följdes och observerades.
Figur 1: Ett grafiskt schema för protokollet för aktivering av mjölksyrabakterier (LAB) kulturer. Schemat ger detaljer och de grundläggande instrument som krävs för hantering och aktivering av LAB-kulturstammar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celltillväxten hos de utvärderade LAB-stammarna som odlades med kvalitetskontrollprotokollet var signifikant annorlunda (P < 0,05) än de stammar som odlades utan detta standardprotokoll. QC-protokollet för både L. bulgaricus och L. reuteri använde en multisubkultureringsmetod (subkulturering tre gånger före ränder på agarplattor), medan kontrollförfarandet endast hade subkulturering gjort en gång med alla andra förhållanden som hölls konstanta. Kolonitillväxten var också högre och väldefinierad på tillväxtmedieplattorna som odlades med hjälp av detta standard QC-protokoll. Detta bekräftade protokollets effektivitet när det gäller att säkerställa förbättrad LAB-tillväxt genom celldelning i den fermentativa buljongen, vilket hjälper till med förbättrad cellmetabolism i LAB-stammarna. Tillväxten av två stammar odlade med och utan det utvecklade kvalitetskontrollprotokollet visas i figur 2. Stammarna strimlades på agarplattor efter att intensiv tillväxt (0,7-0,9 vid OD610 nm) observerats och mätts. Plattorna inkuberades anaerobt vid 42 °C i 72 timmar varefter diskreta kolonier observerades längs streckningslinjerna. En annan studie (figur 3) bekräftade effektiviteten hos kvalitetskontrollprotokollet om tillväxten av Lactobacillus reuteri odlad i TPY-medium och inkuberad vid 37 ° C, varigenom kolonier genererade av QC-protokolltekniken bekräftade en stabil stabil tillväxt (i genomsnitt 0,9 vid OD610 nm) baserat på historiska data. En kontrollmetod för LAB-aktivering utan flera subkulturer som inte använde den utvecklade QC-tekniken resulterade i ett ojämnt tillväxtmönster (0,9-0,75 vid OD610 nm) av L. reuteri.
Figur 2: Kolonial morfologi för tillväxt av L. bulgaricus-stammar odlade med och utan det utvecklade kvalitetskontrollprotokollet. Stammarna var streckade i tre exemplar och inkuberades anaerobelt vid 42 °C i 72 timmar.
Figur 3: Beteende hos L. reuteri under en period efter tillväxt i TPY-medium vid 37 °C med användning av det standardiserade QC-protokollet och den konventionella metoden för bakterieodling (P < 0,05). Tillväxten av L. reuteri övervakades regelbundet under en månad och anpassades till historiska data från tidigare år baserat på odlingsaktivering med standard QC-protokollet. Felstaplarna anger OD-värdenas standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaten av alla stammar som utvärderades med kvalitetskontrollprotokollet och utan användning av protokollet var desamma, och som sådan presenterades resultat kopplade till endast stammar (S9 och LB6). De aktiverade LAB-stammarna hade överlägsen celltillväxt som kännetecknades av en hög intensitet av cellbiomassa, vilket orsakade ett grumligt utseende av MRS-fermentativ buljong i provröret11. Den observerade celltillväxten efter odlingsaktivering var tydlig mellan 12 timmar och 16 timmar vid en anaerob fermentativ temperatur på 42 °C. Det bekräftades också att LAB-stammarna som aktiverades baserat på detta protokoll kontinuerligt fick sina kolonimorfologier transformerade som ett resultat av multi-subodlingsproceduren12 med diskreta kolonier synliga längs streckningslinjerna. Kontrollexperimentet använde inte detta standardprotokoll och subkulturerades bara en gång; det visade emellertid inte också intensiv grumlighet i den fermentativa buljongen, även om tillväxten fortfarande låg inom det accepterade intervallet 0,7-0,9 vid OD610 nm. Det var också anmärkningsvärt att streckning av kontrollkulturerna på agarplattorna och anaerob inkubering av dem under samma förhållanden som standardproceduren endast avbildade mindre och färre kolonier jämfört med de som observerades i standardprotokollet13.
Detta kan hänföras till de svaga och icke-livskraftiga egenskaperna hos LAB-cellerna. Följaktligen resulterar konceptet med subodling av LAB-stammar flera gånger och ränder på agarplattor således i generering av nya celler genom celldelning och utbyte av genetiskt material i bakterierna. Detta förbättrar cellulär och metabolisk funktionalitet och främjar tillväxten av celler under jäsningsoperationer14. Dessutom återvinns stressade och skadade LAB-celler baserat på det stabila tillståndet för tillväxtförhållanden (näringsbehov, pH och temperatur) som gör det möjligt för dem att enkelt anpassa sig och återfå full cell och metabolisk funktionalitet6. Dessutom begränsar strikt efterlevnad av detta protokoll kontaminering av cellkulturer i större utsträckning, vilket säkerställer att endast rena och överlägsna cellkolonier isoleras för jäsningsändamål. Således gav upprepad strimning och återhämtning av LAB-cellkulturer från agarplattor en förbättrad cellvägg som var väl lämpad för metaboliska aktiviteter såsom för LAB-jäsningsoperationer15. Dessutom bekräftar studien om tillväxten av L. reuteri baserat på det utvecklade kvalitetskontrollprotokollet (figur 3) hur subkulturering av LAB via koloni till odlingsmetod ger en stabil stadig tillväxt vid det optimala tillväxtområdet (0,9-1,0 OD 610 nm) under en period jämfört med subkulturering direkt från kultur till kultur (konventionell metod), vilket resulterade i en kraftig tillväxt från 0,75 till 0,9 vid OD610 nm . Det var också uppenbart att QC-protokollet över tid konsekvent gav ett stabilt bakterietillväxtmönster, som hade en standardavvikelse (SD) på 0,1. Den ojämna tillväxten av L. reuteri hade dock sin SD större än 0,1 på grund av den ojämna tillväxten av bakteriecellerna. Detta ojämna tillväxtmönster, som redan nämnts, tillskrevs svaga och skadade celler; således minskade cellernas metaboliska funktionalitet under jäsningsperioden14. Den aktuella studien bekräftades också av en tidigare av Ahmed et al.16 varigenom L. reuteri i deras studie förökades i trypticase pepton jästextrakt (TPY) agarmedium i 8 veckor vid 37 °C. En bidragande faktor för den stadiga tillväxten av L. reuteri tillskrevs metoden för cellodling och kvalitetskontrollteknik som genererade nya och överlägset aktiva kulturer även efter flera subkulturaktiviteter under studieperioden.
De kritiska stegen i detta protokoll inkluderar att alltid använda nya och mindre än en dag gamla fermentativa kulturer och alltid ha den fermentativa buljongen eller tillväxtmediet nyberett innan jäsningen påbörjas och inte använda lagrat tillväxtmedium eftersom mediets styrka och styrka minskar under en längre lagringsperiod. Vid användning av stamkulturer från antingen -80 °C eller -20 °C bör kulturerna hanteras aseptiskt. Dessutom, om stamkulturer observeras vara svaga på grund av kallchock från frysen, krävs återupplivning enligt följande. Endast låga koncentrationer (ca 100 μL) av stamkulturerna bör inokuleras i den kompletterade fermentativa buljongen (MRS) på ca 2 ml för pre-anaerob inkubation i ca 6 timmar innan ytterligare kompletterad MRS på ca 5-6 ml tillsätts för slutlig anaerob inkubation i ca 16 h17. Vid användning av frystorkade eller frystorkade kulturer rekommenderas det starkt att återvinna de frystorkade kulturerna i 3 ml skummjölk och anaerobt inkubera dem i ca 4-5 timmar innan de ympas i den kompletterade fermentativa buljongen, såsom MRS. Dessa processer är nyckeln till att säkerställa LAB-cellviabilitet hela tiden13.
Ett annat kritiskt steg är att säkerställa att celltillväxten av fermentativa kulturer alltid ligger inom tillväxtområdet 0,7-0,9, vilket vanligtvis är vid OD610nm. Detta är viktigt eftersom det tillväxtintervallet rekommenderas som lämplig logg- eller exponentiell fas av bakterietillväxtkurvan17. Varje optisk densitet (OD) värde över 1 är felaktigt eftersom detta bekräftar att de fermentativa kulturerna har nått sin dödsfas med de flesta döda celler och ackumulering av giftigt cellulärt avfall som huvudsakligen finns i det fermentativa mediet. Om ett OD-värde över 1 (OD 610 nm > 1) uppnås rekommenderas att kulturerna späds ut 2 eller 3 gånger eller mer tills det når ett OD-värde under 1 (OD610 nm < 1)18. En annan oro är att på lämpligt sätt inkubera de strimmiga plattorna med de fermentativa kulturerna. Även om de flesta LAB är fakultativa anaerober, är ökad tillväxt begränsad i närvaro av syre; Därför krävs preferensen för anaeroba förhållanden för att främja effektiv tillväxt. Det rekommenderas att använda en CO2-kammare eller ett improviserat kärl som kan generera CO2 under inkubationsperioden vid42 °C. För bästa celltillväxtresultat på inkuberade plattor rekommenderas 72 h för optimala resultat18.
Det finns dock inga begränsningar för detta standardförfarande, eftersom strikt efterlevnad av stegen kommer att säkerställa livskraftiga och rena LAB-celler för fermentativa procedurer. Betydelsen av detta standardprotokoll är baserat på dess proaktiva tillvägagångssätt för att säkerställa probiotisk cellviabilitet, särskilt för fermentativa kulturer. Det fungerar som en kvalitetskontrollmekanism som syftar till att eliminera kontaminering och i slutändan främja starka och mycket livskraftiga kulturer som kan producera önskvärda utbyten av jäsning under standardförhållanden. Med hänvisning till befintliga eller konventionella metoder eliminerar detta standardprotokoll risken för LAB-cellviabilitetsutmaningar (på grund av kall chock och dåligt tillväxtmedium) det syftar också till att säkerställa det första gången rätt konceptet att ha rena och livskraftiga probiotiska kulturer, sparar tid och främjar produktivitet när man arbetar med LAB-kulturer.
De framtida tillämpningarna av denna teknik är enorma, eftersom detta protokoll kan användas i både forskningslaboratorier, mejeri- och livsmedelsindustrier, biobearbetning, jäsning och bioteknikinstitut. Den extra fördelen med detta protokoll är baserad på dess förenklade karaktär och kräver därför inte sofistikerad användning av laboratorieutrustning. Som sådant kan detta protokoll användas för demonstration eller pedagogiskt lärande i gymnasier som har en grundläggande laboratoriemiljö för att uppmuntra och bygga upp intresset för studenter inom naturvetenskap, teknik, teknik och matematik (STEM) relaterade områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna publikation möjliggjordes av bidragsnummer NC. X-267-5-12-170-1 från National Institute of Food and Agriculture (NIFA) och delvis av NIZO Food Research BV, Nederländerna, Jarrow Formulas, USA, och Institutionen för familje- och konsumentvetenskap och jordbruksforskningsstationen vid North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Detta arbete stöddes också delvis av 1890 års kapacitetsuppbyggnadsprogram nr (2020-38821-31113 / projektanslutning nr 021765). Detta arbete stöddes också delvis av det bulgariska ministeriet för utbildning och vetenskap inom ramen för det nationella forskningsprogrammet "Hälsosamma livsmedel för en stark bioekonomi och livskvalitet" som godkänts av DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
References
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
