För att övervinna begränsningarna av klassisk platsriktad mutagenes införlivades prolinanaloger med specifika modifieringar i flera fluorescerande proteiner. Vi visar hur ersättningen av väte med fluor eller singeln med dubbelbindningar i prolinrester (“molekylär kirurgi”) påverkar grundläggande proteinegenskaper, inklusive deras vikning och interaktion med ljus.
Ersättning av prolin (Pro) rester i proteiner med den traditionella platsstyrda mutagenesen med någon av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna är ofta skadlig för proteinveckning och i synnerhet kromoformognad i gröna fluorescerande proteiner och besläktade varianter. Ett rimligt alternativ är att manipulera översättningen av proteinet så att alla Pro-rester ersätts restsubstans specifikt med analoger, en metod som kallas selektiv tryckinkorporering (SPI). De inbyggda kemiska modifieringarna kan användas som en slags “molekylär kirurgi” för att fint dissekera mätbara förändringar eller till och med rationellt manipulera olika proteinegenskaper. Här visar studien nyttan av SPI-metoden för att studera prolinernas roll i organisationen av den typiska β-fatstrukturen av spektrala varianter av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) med 10-15 proliner i sin sekvens: förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP), NowGFP och KillerOrange. Pro-rester finns i anslutande sektioner mellan enskilda β-strängar och utgör de stängande locken på fatställningen, vilket är ansvarigt för isolering av kromoforen från vatten, dvs fluorescensegenskaper. Selektiva tryckinkorporeringsexperiment med (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) utfördes med användning av en prolin-auxotrofisk E. coli-stam som uttrycksvärd. Vi fann att fluorescerande proteiner med S-Flp och Dhp är aktiva (dvs fluorescerande), medan de andra två analogerna (Dfp och R-Flp) producerade dysfunktionella, felveckade proteiner. Inspektion av UV-Vis-absorptions- och fluorescensemissionsprofiler visade få karakteristiska förändringar i proteinerna som innehåller Pro-analoger. Undersökning av de vikande kinetiska profilerna i EGFP-varianter visade en accelererad omfällningsprocess i närvaro av S-Flp, medan processen liknade vildtyp i proteinet innehållande Dhp. Denna studie visar SPI-metodens förmåga att producera subtila modifieringar av proteinrester på atomnivå (“molekylär kirurgi”), som kan antas för studier av andra proteiner av intresse. Det illustrerar resultaten av prolinersättningar med nära kemiska analoger på viknings- och spektroskopiska egenskaper i klassen β fluorescerande proteiner.
Klassisk platsstyrd mutagenes möjliggör permutation av någon befintlig genkodad proteinsekvens genom kodonmanipulation på DNA-nivå. För att studera proteinveckning och stabilitet är det ofta önskvärt att ersätta liknande aminosyror med liknande motsvarigheter. Traditionell proteinmutagenes är dock definitivt begränsad till strukturellt liknande ersättningar bland kanoniska aminosyror som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som finns i standardgenetisk kodrepertoar. Å andra sidan finns det inga sådana möjligheter för andra kanoniska aminosyror som Trp, Met, His eller Pro, som ofta spelar väsentliga strukturella och funktionella roller i proteiner1. Ett idealiskt tillvägagångssätt för att studera dessa interaktioner i samband med den mycket specifika interna arkitekturen hos proteiner och deras vikningsprocess är att generera icke-störande isosteriska modifieringar. Faktum är att när isosteriska aminosyraanaloger av dessa kanoniska aminosyror, även kända som icke-kanoniska aminosyror (ncAA), sätts in i proteiner, möjliggör de subtila förändringar även vid nivån av enskilda atomer eller atomgrupper som H / F,CH2 / S / Se / Te känd som “atommutationer”2. Sådan “molekylär kirurgi” producerar förändrade proteiner vars egenskaper enbart härrör från utbytet av enskilda atomer eller grupper av atomer, vilka i gynnsamma fall kan analyseras och de detekterade förändringarna kan rationaliseras. På detta sätt utvidgas omfattningen av proteinsyntes för att studera proteinveckning och struktur långt bortom klassisk DNA-mutagenes. Observera att proteiner som genereras av platsriktad mutagenes vanligtvis kallas “mutanter”, medan proteiner med substituerade kanoniska aminosyror kallas “varianter” 3, “alloproteiner”4 eller “proteinkongener”5.
Det gröna fluorescerande proteinet (GFP), som först identifierades i den marina organismen Aequorea victoria, uppvisar ljusgrön fluorescens när den utsätts för ultraviolett till blått ljus 6,7. Idag används GFP ofta som ett mycket känsligt märkningsverktyg för rutinmässig visualisering av genuttryck och proteinlokalisering i celler via fluorescerande mikroskopi. GFP har också visat sig vara användbart i olika biofysiska 8,9,10 och biomedicinska 11,12 studier, samt i proteinteknik 13,14,15. Noggrann analys av GFP-strukturen möjliggjorde skapandet av många varianter som kännetecknas av varierad stabilitet och fluorescensmaxima 16,17. De flesta GFP-varianter som används i cell- och molekylärbiologi är monomera proteiner både i lösning och ikristallen 18. Deras huvudsakliga strukturella organisation är typisk för alla medlemmar i GFP-familjen, oberoende av deras fylogenetiska ursprung, och består av 11 β-strängar som bildar en så kallad β-fat, medan en knäckt α-helix löper genom mitten av tunnan och bär kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiska mognaden av kromoforen (figur 1B) kräver exakt positionering av sidokedjorna som omger den på proteinets centrala plats; många av dessa sidokedjor är mycket bevarade i andra GFP-varianter19. I de flesta fluorescerande proteiner från maneter som Aequorea victoria består den grönemitterande kromoforen av två aromatiska ringar, inklusive en fenolring av Tyr66 och den femledade heterocykliska strukturen av imidazolinon (figur 1B). Kromoforen, när den är korrekt inbäddad i proteinmatrisen, är ansvarig för den karakteristiska fluorescensen hos hela proteinet. Den är belägen i mitten av strukturen, medan fatstrukturen isolerar den från det vattenhaltiga mediet20. Exponering av kromoforen för bulkvattnet skulle resultera i fluorescenssläckning, dvs förlust av fluorescens21.
Korrekt vikning av den fatliknande strukturen är avgörande för att skydda kromoforen mot fluorescenssläckning22. Proline (Pro) rester spelar en särskild roll i den strukturella organisationen av GFP23. Eftersom de inte kan stödja en β utgör de anslutningsslingor som är ansvariga för att upprätthålla proteinstrukturen som helhet. Inte överraskande finns 10-15 prolinrester i både Aequorea– och Anthoathecata-härledda GFP: er; några av dem är mycket bevarade i andra typer av fluorescerande β-fatproteiner. Proliner förväntas kritiskt påverka vikningsegenskaperna på grund av deras speciella geometriska egenskaper. Till exempel, i Aequorea-härledda GFP, av de tio prolinresterna (figur 2A), bildar nio trans– och endast en bildar en cis-peptidbindning (Pro89). Pro58 är väsentlig, dvs inte utbytbar med resten av de 19 kanoniska aminosyrorna. Denna rest kan vara ansvarig för korrekt positionering av Trp57-återstoden, som har rapporterats vara avgörande för kromoformognad och den totala GFP-vikningen24. Fragmentet PVPWP med tre prolinrester (Pro54, Pro56, Pro58) och Trp57 är den väsentliga delen av det “nedre locket” i GFP-strukturen från figur 1A. PVPWP-strukturmotivet finns i flera proteiner såsom cytokromer och eukaryota spänningsaktiverade kaliumkanaler25. Prolin-till-alanin substitutioner vid positionerna 75 och 89 är också skadliga för proteinuttryck och vikning och avskaffar kromoformognad. Pro75 och Pro89 är en del av det “övre locket” som begraver kromoforen (figur 1A) och bevaras över 11-strängade β-fat fluorescerande proteiner23. Dessa två “lock” håller kromoforen utesluten från det vattenhaltiga lösningsmedlet, även när den stabila tertiära strukturen delvis har brutits26. En sådan specifik molekylär arkitektur skyddar fluoroforen från kollisionssläckning (dynamisk) fluorescenssläckning, t.ex. av vatten, syre eller andra diffusibla ligander.
För att utföra molekylär konstruktion av GFP-strukturen bör man införa aminosyrasubstitutioner i proteinets primära struktur. Många mutationer har utförts på GFP, vilket ger varianter med förhöjd stabilitet, snabb och pålitlig vikning och variabla fluorescensegenskaper17. I de flesta fall anses emellertid mutation av prolinrester vara ett riskabelt tillvägagångssätt på grund av det faktum att ingen av de återstående 19 kanoniska aminosyrorna korrekt kan återställa prolinrestens konformationsprofil27. Således har ett alternativt tillvägagångssätt utvecklats, där prolinrester ersätts med andra prolinbaserade strukturer, kallade prolinanaloger28. På grund av sin unika cykliska kemiska struktur uppvisar prolin två karakteristiska konformationsövergångar (figur 1C): 1) prolinringen puckering, en snabb process som medför organisering av ryggraden, som främst påverkar φ torsionsvinkel, och 2) peptidbindningen cis / transisomerisering, en långsam process som påverkar ryggradsvikningen via ω-torsionsvinklarna. På grund av sin långsamma natur är den senare övergången vanligtvis ansvarig för de hastighetsbegränsande stegen i vikningsprocessen för hela proteinet. Det har tidigare visats att peptidbindning cis / transisomerisering runt vissa prolinrester har långsamma steg i vikningen av GFP-varianter. Till exempel har bildandet av cis-peptidbindningen vid Pro89 det långsamma steget i vikningsprocessen eftersom det är beroende av bindningsövergången från trans till cis29. En snabbare omfällning kan uppnås efter att Pro89 har ersatts med en all-trans-peptidslinga, dvs genom att avskaffa en cis-till-trans-isomeriseringshändelse30. Förutom cis/trans-isomeriseringen kan puckerövergångarna också generera djupgående förändringar i proteinveckning på grund av ryggradsorganisationen och förpackningen inom proteininteriören27,31.
Kemiska modifieringar resulterar i förändring av de inneboende konformationsövergångarna hos prolinresterna, vilket påverkar proteinets förmåga att vikas. Vissa prolinanaloger är särskilt attraktiva kandidater för prolinsubstitution i proteiner eftersom de möjliggör manipulation och studier av vikningsegenskaperna. Till exempel är (4R)-fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluorprolin (Dfp) och 3,4-dehydroprolin (Dhp) fyra analoger (figur 1D) som skiljer sig minimalt från prolin när det gäller både molekylvolym och polaritet32. Samtidigt uppvisar varje analog en distinkt ringpubbning: S-Flp stabiliserar C 4-endo pucker, R-Flp stabiliserar C4-exo pucker, Dfp uppvisar ingen uppenbar puckerpreferens, medan Dhp avskaffar puckering (figur 1D)33. Genom att använda dessa analoger i proteinstrukturen kan man manipulera med den konformationella övergången av prolinresterna och därigenom påverka egenskaperna hos de resulterande GFP-varianterna.
I detta arbete bestämde vi oss för att införliva den angivna uppsättningen prolinanaloger (figur 1D) i strukturen hos GFP-varianter med hjälp av den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI, figur 3) 34. Ersättning av aminosyrarester med deras närmaste isostrukturella analoger är ett tillämpat biotekniskt koncept i proteindesign35,36. Således illustrerar effekterna av prolinanaloger i ett modellprotein deras potential att fungera som verktyg inom proteinteknik37. Produktionen av proteiner innehållande önskade analoger utfördes i modifierade E. coli-stammar som inte kan producera prolin (prolin-auxotrofi). Således kan de tvingas acceptera ersättning av substrat i processen med proteinbiosyntes38. Denna globala substitution av prolin möjliggörs av den naturliga substratflexibiliteten hos endogena aminoacyl-tRNA-syntetaser39, de viktigaste enzymerna som katalyserar förestringen av tRNA med lämpliga aminosyror40. I allmänhet, som beskrivs i figur 3, utförs cellulär tillväxt i ett definierat medium tills den mellersta logaritmiska tillväxtfasen uppnås. I nästa steg utarmas aminosyran som ska ersättas intracellulärt från uttryckssystemet under jäsning och utbyts därefter av den önskade analogen eller ncAA. Målproteinuttryck induceras sedan för restspecifik icke-kanonisk aminosyrainkorporering. Substitutionen av den besläktade aminosyran med dess analog sker på ett proteombrett sätt. Även om denna biverkning kan ha en negativ inverkan på tillväxten av värdstammen, påverkas kvaliteten på målproteinproduktionen för det mesta inte, eftersom de cellulära resurserna i rekombinant uttryck huvudsakligen riktas mot produktionen av målproteinet41,42. Därför är ett hårt reglerat, inducerbart uttryckssystem och starka promotorer avgörande för hög inkorporeringseffektivitet43. Vårt tillvägagångssätt är baserat på multipel restspecifik inkorporering av ncAA som svar på sinneskodoner (sinneskodonreasplacering), varigenom antalet positioner för Pro-analog insättning inom målgenen kan manipuleras via platsriktad mutagenes44. Ett liknande tillvägagångssätt tillämpades i vår tidigare rapport om framställning av rekombinanta peptider med antimikrobiella egenskaper45. I detta arbete har vi tillämpat SPI-metoden, som gör att alla prolinrester kan ersättas med relaterade analoger, för att generera proteiner som förväntas ha distinkta fysikalisk-kemiska egenskaper som inte finns i proteiner syntetiserade med den kanoniska aminosyrarepertoaren. Genom att karakterisera viknings- och fluorescensprofilen för resulterande varianter strävar vi efter att visa upp effekterna av atomsubstitutioner i varianter av GFP.
I naturen uppträder manipuleringar med proteinstrukturer och funktioner vanligtvis på grund av mutationer, fenomenet som leder till ett utbyte av en aminosyraidentitet vid vissa positioner i proteinsekvensen. Denna naturliga mekanism tillämpas allmänt som en bioteknisk metod för proteinteknik i form av mutagenes, och den bygger på repertoaren av de 20 kanoniska aminosyrorna som är involverade i processen. Utbytet av prolinrester är dock problematiskt. På grund av sin speciella ryggradsgruppsarkitektur är den knappast utbytbar med de återstående 19 resterna för ersättning72. Till exempel är prolin typiskt känd som en sekundär strukturbrytare i polypeptidsekvenser på grund av dess dåliga kompatibilitet med de vanligaste sekundära strukturerna, dvs α-helix och β-sträng. Denna prolinfunktion går lätt förlorad när återstoden muteras till en annan aminosyra från den gemensamma repertoaren. Ersättningen av prolin med dess kemiska analoger erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt, vilket gör det möjligt att behålla de grundläggande ryggradsegenskaperna hos moderprolinresten samtidigt som man ålägger bias på dess specifika konformationsövergångar eller producerar moduleringar av molekylvolymen och polariteten. Det är till exempel möjligt att leverera bakteriekulturer med analoga strukturer såsom hydroxi-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer med varierande ringstorlekar och mer, vilket underlättar produktionen av ett protein som innehåller specifika prolinrestförändringar.
Den selektiva tryckinkorporeringsmetoden (SPI) som beskrivs i denna studie möjliggör en global, dvs. restspecifik ersättning av alla proliner i målproteinet med relaterade kemiska analoger. Metodens betydelse återspeglas av det faktum att SPI gör det möjligt att skapa sekvensförändringar som är otillgängliga för vanliga mutagenstekniker. Till exempel tillåter det produktion av ett målprotein som innehåller ganska små strukturella förändringar som vanligtvis inte får överstiga en eller två atomersättningar / deletioner / tillägg, vilket demonstreras i denna studie. Sådana proteinmodifieringar kallas “atommutationer”73,74. I ett fluorescerande protein såsom GFP kan resultatet av detta molekylära intrång ses i vikningshastigheten, lokala polariteter, proteinförpackning, stabilitet hos de involverade strukturella egenskaperna. Förändringarna i absorbans- och fluorescensegenskaperna produceras indirekt på grund av påverkan på proteinveckning och restmikromiljöer. Precisionen hos de molekylära förändringar som utförs av SPI är vanligtvis mycket högre, jämfört med mutationer av proliner till andra kanoniska rester, den senare är typiskt skadlig för proteinveckningen, produktionen och isoleringen.
Som en produktionsmetod använder SPI-metoden substrattoleransen för aminoacyl-tRNA-syntetasfickan mot kemiska analoger av den inhemska aminosyran. Syntetasen är ansvarig för korrekt identifiering av aminosyrastrukturen, medan införlivandet i proteiner sker nedströms i översättningsprocessen. Instrumentellt utförs proteinproduktionen, isoleringen och reningen i SPI på ett sätt som är typiskt för alla andra rekombinanta proteinuttryckstekniker; emellertid med vissa tillägg till protokollet enligt följande: Proline, som är bunden för ersättning, tillhandahålls i början av jäsningsprocessen, så att cellerna kan växa och utveckla sitt intakta cellulära maskineri. Cellkulturen får emellertid inte nå den maximala optiska densiteten, för att hålla cellerna i den logaritmiska fasen optimal för proteinuttryck. Det finns två stora variationer av SPI-metoden vid denna tidpunkt. I den första justeras koncentrationen av prolin i det initiala tillväxtmediet (ett kemiskt definierat medium) så att utarmning av prolin sker utan något yttre intrång. Cellerna avgaser prolin i mediet innan de kan lämna den logaritmiska tillväxtfasen, och därefter tillsätts analogen och proteinet av intresseproduktion induceras. I den andra versionen av metoden odlas cellerna i mediet innehållande prolin fram till mitten av deras logaritmiska fas. Vid denna tidpunkt bör cellerna tas ut och fysiskt överföras till ett annat medium, som inte längre innehåller prolin, endast analogen, med efterföljande induktion av proteinet av intresse. I båda versionerna tillhandahålls analogen och proteininduktionsreagenset till de förvuxna cellerna. Isoleringen och reningen av vildtypsproteinet utförs på samma sätt som för varianterna. I princip kan varje tillgänglig pro-auxotrofisk stam användas som uttrycksvärd. Ändå rekommenderas uttryckstester för att identifiera den lämpligaste värden. Tester av olika kemiskt definierade medier kan också användas för att optimera proteinutbytet.
Det finns vissa krav på kemiska analoger som måste beaktas för SPI, såsom löslighet och koncentration. Den metaboliska tillgängligheten och upptaget av aminosyror är beroende av antalet upplösta molekyler i mediet. För att öka lösligheten hos en viss förening kan svagt sura eller alkaliska förhållanden väljas. Eftersom de konstgjorda molekylerna kan orsaka tillväxthämmande effekter på grund av deras celltoxicitet, bör koncentrationen sänkas till ett minimum för att undvika cellstress75.
En mindre svaghet i SPI är minskningen av inkorporeringseffektiviteten med ett större antal positioner som behöver bytas ut. I princip kan en minskning av aminosyrafrekvensen inom målbiomolekylen genom platsriktad mutagenes lösa detta problem. De strukturella och funktionella egenskaperna hos ett önskat protein kan emellertid påverkas av att ändra den primära strukturen.
Som nämnts tidigare tillåter SPI restspecifik ersättning av den kanoniska aminosyran. Detta innebär att icke-kanoniska aminosyror sätts in i varje position av den kanoniska aminosyran i målproteinet, inklusive konserverade rester som är oumbärliga för proteinfunktion eller vikning. Alternativa metoder för platsspecifik inkorporering är den enda möjligheten att lösa detta problem3. Under de senaste decennierna har den ortogonala parmetoden utvecklats som kan producera proteiner som innehåller modifierade rester på fördefinierade platser. Den vanligaste modifieringen av denna metod är känd som stoppkodonundertryckning. Denna metod är baserad på ett konstruerat ortogonalt översättningssystem dedikerat för platsspecifik inkorporering av syntetiska aminosyror76. Mer än 200 aminosyror med olika sidokedjemodifieringar har hittills införlivats i proteiner med hjälp av detta tillvägagångssätt77. Dessa översättningssystem är emellertid fortfarande inte lämpliga för införande av prolinanaloger i målproteiner. Vidare anses metodens prestanda vara låg vid mindre aminosyramodifieringar eftersom viss bakgrundspromiskuitet hos aminoacyl-tRNA-syntetaset typiskt kvarstår i de konstruerade översättningssystemen.
Med hjälp av SPI producerade vi ett antal β-fat fluorescerande proteinvarianter och studerade resultaten av utbytet av prolin med dess onaturliga analoger. Vid prolinersättning med R-Flp och Dfp producerades ett dysfunktionellt protein av uttrycksvärden. Effekten produceras sannolikt av felveckning av protein. Den senare kan härröra från C4-exo-konformationen som främjas av R-Flp, som är ogynnsam av moderproteinstrukturerna27. Med Dfp kommer felveckningen sannolikt att produceras genom den minskade hastigheten hos trans-till-cis-peptidbindningsisomeriseringen vid prolinresten27. Det senare är känt för att vara bland de begränsande stegen i den kinetiska profilen för proteinveckningen som påverkar β-fatbildning och efterföljande kromoformognad. För både aminosyror, R-Flp och Dfp resulterade proteinproduktionen i ett aggregerat och olösligt protein. Följaktligen kunde kromoforbildning inte inträffa, och fluorescensen förlorades helt. Med S-Flp och Dhp observerades dock korrekt proteinmognad, vilket resulterade i fluorescerande proteinprover för varje analog / proteinkombination. Trots vissa moduleringar i proteinets absorbans- och fluorescensegenskaper förblev dessa i stor utsträckning liknande dem hos vildtypsproteinerna. Effekten av aminosyrasubstitutionen avslöjades i de refolding kinetikstudierna. Den senare visade en snabbare omfällning vid ersättning med S-Flp. Modellstudier har visat att denna rest kan generera en viss förbättring av trans-till-cis-amidrotationshastigheten och leda till bildandet av C 4-endo-konformationen. Båda dessa faktorer kommer sannolikt att bidra till de fördelaktiga kinetiska effekterna av denna rest i EGFP. Däremot producerade Dhp kinetiska vikningsprofiler som maximalt liknar moderproteinet. Mångfalden av de resultat som produceras av enbart atommutationer i de undersökta fluorescerande proteinerna illustrerar potentialen hos SPI-produktionsmetoden för att förändra målproteinegenskaperna. Proteinförändringarna inducerade av prolinersättning med analogerna har ytterligare konsekvenser vid konstruktion av enzymer 78,79,80 och jonkanaler 81,82, liksom i allmänhet konstruktion av proteinstabilitet.
Den grundläggande begränsningen av SPI-metoden är dess “allt-eller-ingen” -läge vid utbyte av prolin finns med relaterade analoger. Det skulle vara till stor fördel att kunna välja exakt, vilka prolinrester som ska ersättas med analogerna och vilka som ska förbli oförändrade. För närvarande finns det emellertid ingen teknik som kan utföra en så sofistikerad produktion med hjälp av en mikrobiell produktionsvärd. Kemisk syntes av proteiner 83,84, liksom cellfri produktion85,86, är de två alternativa metoderna som kan producera positionsspecifika prolinmodifieringar. Ändå gör deras operativa komplexitet och låga produktionsutbyten dem sämre jämfört med produktionen i levande celler. Från och med nu är SPI fortfarande det mest operativt enkla och robusta tillvägagångssättet för produktion av komplexa proteiner som bär atommutationer. Genom att införa onaturliga aminosyrasubstitut möjliggör metoden modifiering av proteinegenskaper på ett målinriktat sätt, vilket exemplifieras här av förändringar i vikning och ljusabsorption / utsläpp av fluorescerande proteiner som genereras av prolinersättningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (Cluster of Excellence “Unifying Systems in Catalysis) till T.F. och N.B. och av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF-programmet “HSP 2020”, TU-WIMIplus Project SynTUBio) till F.-J.S. och T.M.T.T.
Acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) | Carl Roth | 3029.1 | |
Agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Ammonium peroxydisulphate (APS) | Carl Roth | 9592.2 | ≥98 %, p.a., ACS grade required |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
Copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | ≥99 %, p.a., for electrophoresis |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) | Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) | 10731181 | cation exchange resin |
Ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
Formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
Glacial acetic acid | Carl Roth | 3738.5 | 100 %, p. a. |
Glycerol | Carl Roth | 3783 | |
Imidazole | Carl Roth | X998 | |
Hydrogen chlroide (HCl) | Merck | 295426 | |
Iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
Isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
Manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | |
Potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tryptone | Carl Roth | 8952 | |
Yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
Zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
(4S)-fluoroproline | Bachem | 4033274 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression. |
(4R)-fluoroproline | Bachem | 4033275 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
3,4-dehydroproline | Bachem | 4003545 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
4,4-difluoroproline | Enamine | EN400-17448 | Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression |
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | GE Healthcare | HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01 | |
Luer-Lock syringe, 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
Luer-Lock syringe, 20 mL | Carl Roth | T550.1 | |
Luer-Lock syringe, 50 mL | Carl Roth | T552.1 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 | Addgene | 50348 | https://www.addgene.org/50348/ |
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 | ATCC | 35607 | |
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | |
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | |
Mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
Fluorescence spectrometer | Perkin Elmer | LS 55 | |
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
Orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) | GE Healthcare | P-1 | |
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
UV-Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
UV-Vis/NIR spectrophotometer | Perkin Elmer | LAMBDA 950 UV/Vis/NIR |