Mätning av egenskaper hos det periodiska skelettet i Axons ursprungliga segment med hjälp av 3D-strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM)
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera och mäta aktin ringar och andra komponenter i membranet periodiska skelettet i axon inledande segmentet med hjälp av odlade råtta hippocampal nervceller och 3D-strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM).
Abstract
Axon initiala segmentet (AIS) är den plats där aktionspotentialer initierar och utgör ett transportfilter och diffusionsbarriär som bidrar till upprätthållandet av neuronal polaritet genom sortering av somato-dendritisk last. Ett membran periodiskt skelett (MPS) bestående av periodiska aktinringar ger en byggnadsställning för förankring av olika AIS-proteiner, inklusive strukturella proteiner och olika jonkanaler. Även om de senaste proteomiska metoderna har identifierat ett betydande antal nya AIS-komponenter, saknas detaljer om mps struktur och rollerna för dess enskilda komponenter. Avståndet mellan enskilda aktinringar i MPS (~190 nm) kräver anställning av superupplösningsmikroskopitekniker för att lösa de strukturella detaljerna i MPS. Detta protokoll beskriver en metod för att använda odlade råtta hippocampal nervceller för att undersöka den exakta lokaliseringen av ett AIS-protein i MPS i förhållande till sub-membranous aktin ringar med hjälp av 3D-strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM). Dessutom beskrivs en analytisk metod för att kvantitativt bedöma perioditeten hos enskilda komponenter och deras position i förhållande till aktinringar.
Introduction
Axon initiala segmentet (AIS) är en kort, unikt specialiserad region av proximal axon av ryggradsdjur nervceller1. AIS består av ett transportfilter och diffusionsbarriär som är avgörande för att upprätthålla neuronal polaritet genom att sortera somato-dendritisk last2,3,4,5,6,7. Dessutom gör AIS unika struktur det möjligt att rymma kluster av spänningsgrindade jonkanaler som underlättar dess funktion som platsen för åtgärdspotentialinitiering8. Ett mycket stabilt strukturellt komplex ligger till grund för AIS unika funktioner. Forskning under det senaste decenniet har visat närvaron av ett membran periodiskt skelett (MPS) som innehåller aktinringar kopplade med spektrin och ger en byggnadsställning för förankring av olika AIS-proteiner9,10.
Avståndet mellan aktinringar i MPS (~190 nm)9,10 ligger under upplösningsgränsen för konventionell ljusmikroskopi. Tidiga försök att använda elektronmikroskopi för att visualisera MPS var inte framgångsrika, eftersom de hårda förberedelseförfarandena misslyckades med att bevara MPS struktur. Således har superupplösningsmikroskopitekniker visat sig vara ovärderliga för att klargöra några av de strukturella detaljerna i MPS11. Förståelsen av AIS strukturella komplex, identiteten och funktionerna hos dess komponenter och dess spatiotemporal reglering är dock fortfarande ofullständig. Nyligen proteomiska studier lyckades skapa en betydande lista över proteiner som lokaliseras till AIS nära strukturella komponenter i AIS12,13. Ändå saknas detaljer om deras funktion och exakta plats i AIS-komplexet. Således fungerar superupplösningsmikroskopitekniker som ett viktigt verktyg för att undersöka dessa proteiners exakta positioner i förhållande till andra MPS-komponenter och undersöka deras funktioner. Flera lätta mikroskopitekniker kan uppnå upplösningar högre än ljusets diffraktiongräns, vissa kan till och med lokalisera enskilda molekyler. Många av dessa tekniker kräver dock vanligtvis specialiserade fluoroforer eller bildbuffertar, och bildförvärv är ofta tidsintensivt14.
3D strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM), på grund av dess användarvänlighet och enkla krav på provberedning, kräver inga speciella reagenser för avbildning eller provberedning, fungerar bra med ett brett utbud av fluoroforer och prover, kan enkelt implementeras i flera färger och kan live-cellsavbildning15. Medan den bästa möjliga upplösning SIM-erbjudandet (~ 120 nm) är låg jämfört med många andra superupplösningstekniker, är det tillräckligt för många applikationer (till exempel för att lösa komponenterna i MPS i neuroner). Därför är det viktigt att överväga kravet på specifika applikationer för att avgöra om SIM är ett lämpligt val eller om en ännu högre upplösning är nödvändig. Här beskrivs ett protokoll för användning av odlade hippocampala nervceller och 3D-strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM) för att undersöka positionen och organisationen av förmodade AIS-proteiner i förhållande till aktinringar i MPS, som implementeras i Abouelezz et al.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en metod för att visualisera och mäta MPS-proteiner med hjälp av superupplösningstekniken. Eftersom aktinringar och andra MPS-komponenter visar en periodicitet på ~ 190 nm9,10, kan konventionella diffraktionsbegränsade avbildningsmetoder inte avslöja detaljerna i MPS. Flera mikroskopiinställningar kan lösa diffraktionsbegränsade strukturer i superupplösning, och SIM representerar ett robust och okomplicerat alternativ….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Pirta Hotulainen är erkänd för sina kritiska kommentarer, ovärderliga för att förbereda detta manuskript. Dr. Rimante Minkeviciene är erkänd för sin hjälp med att förbereda de neuronala kulturer som används för de ursprungliga experimenten. All bildbehandling utfördes i Biomedicum Imaging Unit. Detta arbete stöddes av Finlands Akademi (D.M., SA 266351) och doktorandprogrammet Brain & Mind (A.A.)
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
