Questo protocollo descrive come estrarre la proteina 1 contenente dominio della fumarilacetoacetato idrolasi (FAHD1) dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi elencati possono essere adattati ad altre proteine di interesse e modificati per altri tessuti.
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Articolo metodologico
Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina 1 contenente dominio fumarilacetato idrolasi (FAHD1) è il primo membro identificato della superfamiglia FAH negli eucarioti, che agisce come ossalacetato decarbossilasi nei mitocondri. Questo articolo presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi coperti sono la cromatografia a scambio ionico con cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), la filtrazione preparativa e analitica del gel con FPLC e gli approcci proteomici. Dopo l'estrazione totale delle proteine, sono state esplorate la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico e FAHD1 è stato estratto tramite una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo approccio rappresentativo può essere adattato ad altre proteine di interesse (espresse a livelli significativi) e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici.
Introduzione
La proteina 1 contenente dominio FAH eucariotico (FAHD1) agisce come ossalacetato bifunzionale (OAA) decarbossilasi (ODx)1 e idrolasi acilpropurato (ApH)2. È localizzato nei mitocondri2 e appartiene all'ampia superfamiglia FAH degli enzimi 1,2,3,4,5,6. Mentre la sua attività ApH è solo di minore rilevanza, l'attività ODx di FAHD1 è coinvolta nella regolazione del flusso del ciclo ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto delle linee guida istituzionali. Il rene suino è stato ottenuto fresco dal supermercato locale. I tessuti epatici sono stati raccolti da topi selvatici C57BL6 mantenuti presso l'Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico dell'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, coperto da autorizzazione etica come leader del progetto rilasciata nel 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). La manutenzione e l'uso dei topi per il progetto sono coperti dal permesso etico n. 2020-0.242.978 dal 5 maggio 2020, rilasciato dal Ministero austriaco pe....
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Risultati
La proteina FAHD1 è stata estratta dal rene suino e dal fegato di topo utilizzando il protocollo presentato. Per il tessuto di topo, sono necessari più organi per ottenere diversi μg dopo la fase finale di purificazione. Per questo motivo, questo articolo si concentra sull'estrazione di FAHD1 dai reni suini, che è un esperimento molto più esemplare. L'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo viene eseguita per presentare le difficoltà e le possibili insidie di questo protocollo. Si raccomanda generalmente di utilizzare org.......
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Discussione
Passaggi critici nel protocollo
Seguire le linee guida comuni per la manipolazione delle proteine è essenziale, come lavorare sul ghiaccio e in condizioni di pH e sale moderate. L'uso di inibitori della proteasi è benefico per il metodo, mentre l'uso di inibitori del proteasoma è altamente raccomandato. Il congelamento e lo scongelamento del campione possono sempre comportare la precipitazione proteica (almeno parzialmente), pertanto qualsiasi aliquota scongelata del lisato proteico iniziale (fase 2) .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori sono molto grati per l'assistenza tecnica di Ayse Öztürk ed Eva Albertini. I topi utilizzati per la generazione di tessuto epatico sono stati mantenuti sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico presso l'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m unità filtranti | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0,22 µ m, PES 33 mm, non sterile |
| 0,45 µ m unità filtranti | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0,45 & micro; m, PES 33 mm, non sterile |
| 15 mL Provette Falcon | VWR | 734-0451 | provette centrifughe |
| 50 mL Provette Falcon | VWR | 734-0448 | provette centrifughe |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS trasparente a fondo piatto 96 pozzetti |
| Soluzione acrilammide/Bis (40%, rapporto 29:1) | BIO-RAD | #1610147 | Soluzione di acrilammide/bis-acrilammide al 40%, 29:1 (3,3% reticolante) per colata di gel di poliacrilammide |
| Ä Sistema KTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences / | Cytiva-utilizzando | il sistema FPLC di GE Healthcare; esistono diverse versioni personalizzate; questo lavoro ha utilizzato il "Ä Sistema "KTA pure" |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | filtri centrali per l'arricchimento delle proteine; 10 kDa filtro di massa molecolare; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | filtri centrali per l'arricchimento delle proteine; 10 kDa filtro di massa molecolare; 4 mL |
| di solfato di ammonio in polvere | MERCK | A4418 | solfato di ammonio per la biologia molecolare, ≥ 99,0% |
| di grado di reagente di persulgrasso di ammonio, 98% | di | MERCK 215589 | per la polimerizzazione di gel di acrilammide. |
| Coomassie Blu brillante R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Blu brillante R 250 (C.I. 42660) per elettroforesi Marchio di fabbrica di Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 gradi; C) |
| Tubi per dialisi, membrana in cellulosa | MERCK | D9277, | membrane in cellulosa per la sostituzione di tamponi tramite dialisi. |
| Provette Eppendof 1,5 mL | VWR | 525-1042 | provette per microcentrifuga; autoclavate |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | Le colonne preimpaccate HiLoad Superdex 75 pg sono per la cromatografia ad esclusione dimensionale ad alta risoluzione di proteine ricombinanti |
| Membrana PVDF Immun-Blot | BIO-RAD | #1620177 | Le membrane in PVDF sono membrane di blotting proteico ottimizzate per applicazioni fluorescenti e multiplex. |
| Cella di trasferimento elettroforetica Mini Trans-Blot | BIO-RAD | #1703930 | Utilizzare la cella Mini Trans-Blot per la rimozione rapida di gel prefabbricati e fusi a mano Mini-PROTEAN. |
| Cella di elettroforesi verticale Tetra Mini-PROTEAN per mini gel prefabbricati | BIO-RAD | #1658004 | sistema di elettroforesi verticale a 4 gel, include gruppo elettrodo, modulo di corsa compagno, serbatoio, coperchio con cavi di alimentazione, diga tampone per mini celle. |
| Le colonne Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q sono colonne per cromatografia a scambio anionico forte per l'analisi delle proteine o per la lucidatura su piccola scala e ad alta risoluzione delle proteine. |
| Le colonne Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S sono colonne cromatografiche a scambio cationico per l'analisi delle proteine o la lucidatura ad alta risoluzione su piccola scala delle proteine. |
| PageRuler Scala di proteine prestainate, da 10 a 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | Una miscela di 10 proteine colorate di blu, arancione e verde (da 10 a 180 kDa) da utilizzare come standard dimensionale nell'elettroforesi delle proteine (SDS-PAGE) e nel western blotting. |
| Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA | Thermo-Fischer | 23225 | Un test proteico bicomponente, ad alta precisione e compatibile con i detergenti, per la determinazione della concentrazione proteica. |
| Sonificatore 250; Disgregatore cellulare ad ultrasuoni con convertitore | Branson-Nuovi | modelli presso https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf | |
| Suino Anti-coniglio Immunoglobuline/HRP (isolate per affinità) | Agilent Dako | P0399 | L'anticorpo utilizzato per la coniugazione della perossidasi di rafano reagisce con le immunoglobuline di coniglio di tutte le classi. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimetilammino)etano, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina) è una molecola che consente una rapida polimerizzazione di gel di poliacrilammide. |
| Rullo per tubi | - | - | Un rullo rotatore per tubi generale; ad esempio un nuovo modello a https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Rotatore per tubi | - | - | Una ruota rotatrice per tubi generale; ad esempio un nuovo modello a https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | Nuovi modelli in https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
Riferimenti
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al.
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Ristampe e permessi
