呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離
Summary
ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。
Abstract
細胞のエネルギーの大部分は、細胞の要求に応じて調節されるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)系に収束する異なる経路によるグルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の分解によって得られる。脂質分子コエンザイムQ(CoQ)は、一定の酸化/還元サイクルを通じて電子輸送鎖(ETC)内の複合体IIIに電子を伝達することによって、このプロセスにおいて不可欠である。ミトコンドリアの状態、そして最終的には、細胞の健康状態は、呼吸測定アッセイを用いてETC酸素消費量を測定することによって評価することができる。これらの研究は、典型的には、数日間培養された樹立または初代細胞株において行われる。両方の場合において、得られた呼吸パラメータは、任意の所与の器官または組織において正常な生理学的状態から逸脱していてもよい。
さらに、骨格筋から単離された培養単繊維の固有の特性は、このタイプの分析を妨げている。この論文は、マウス骨格筋から新たに単離されたミトコンドリアにおける呼吸の分析のための最新かつ詳細なプロトコルを提示する。また、プロセスのどの段階でも発生する可能性のある潜在的な問題に対するソリューションも提供します。ここで提示された方法は、多様なトランスジェニックマウスモデルにおける酸素消費速度を比較し、薬物治療または加齢または性別などの他の要因に対するミトコンドリア応答を研究するために適用することができる。これは、ミトコンドリアの生体エネルギー学の代謝と調節に関する重要な質問に答えるための実行可能な方法です。
Introduction
ミトコンドリアは細胞内の主要な代謝小器官1です。これらの特殊な膜密閉細胞小器官は、栄養分子を使用して、OXPHOSによってアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成する。このプロセスは、ETC2における一連の酸化還元反応におけるドナー分子からの電子の移動に依存する。CoQは、抗酸化機能を示すすべての細胞膜および循環リポタンパク質で内因的に産生される唯一の酸化還元活性脂質である3。これはETCの必須成分であり、NADH依存性複合体IおよびFADH2依存性複合体IIから複合体IIIに電子を伝達するが、他の多くのレダクターゼは、複数の細胞代謝経路における必須ステップとしてミトコンドリアCoQのユビキノールへの還元を駆動することができる4,5。
このプロセスを通して、ミトコンドリア内膜を横切って電気化学的プロトン勾配が作成され、ATP合成酵素複合体V2によって生物学的に活性なエネルギーに変換される。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、主に高エネルギー要求を有する組織(脳、心臓、骨格筋)に影響を及ぼす無数の病理学的状態をもたらす6,7。したがって、ミトコンドリアの生体エネルギー学を正確に解析し、健康や病気、特に骨格筋などの高エネルギー組織におけるミトコンドリアの生体エネルギー学の役割を調べる方法を開発することが不可欠です。
クラーク型酸素電極は、ミトコンドリア呼吸の研究で古典的に使用されています8。しかし、このシステムは徐々に高分解能技術に取って代わられており、Agilent Seahorse XF分析装置などのマイクロプレートベースの酸素消費技術が特に人気があります9。骨格筋分野では、これらの研究は通常、主にC2C12不死化マウス筋芽細胞株またはサテライト細胞に由来する初代培養細胞において、培養細胞において実施される10,11。しかし、これらの研究は、特に特定の侮辱、非遺伝的介入、または遺伝子操作による組織レベルでのミトコンドリア生物学および機能を調査する場合、インビボでの状況を完全に要約していない。
さらに、細胞内の呼吸アッセイは、ATPおよびアッセイ基質のミトコンドリア外要求またはシグナル伝達事象を含む追加の要因のためにより複雑であり、結果の解釈を誤解させる可能性がある。あるいは、筋肉から単離されたばかりの筋線維の単一または束を用いることもできる。しかし、単離方法は技術的に困難であり、いくつかの筋肉タイプに対してのみ実現可能である。この場合、屈筋デジトルム・ブレビス(FDB)および伸筋デジトルム・ロンガス(EDL)筋が主に使用されていますが10,12,13が,他の筋肉型の使用についても記述されている報告もあります14,15。
骨格筋切片の生体エネルギープロファイリングも報告されている16。この方法の主な利点は、無傷の筋肉を研究できることである(著者らは、単離された筋線維と比較して、線維をスライスしても結果を妨げないことを示している)。しかし、基質およびアッセイ阻害剤へのミトコンドリアのアクセスは限られているため、測定できるパラメータはごくわずかです16。最後に、単離されたミトコンドリアも同様に採用することができる9、17、18、19。この場合、ミトコンドリアは細胞質ゾル環境を失い、その機能に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は、基質および阻害剤へのアクセスを保証し、多数のサンプルタイプの分析を可能にし、典型的にはより少ない材料を必要とする。
本稿では、マイクロプレートベースの呼吸法アッセイを用いてマウス骨格筋から単離されたミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングを行う方法を記載する(図1)。特に、3つのプロトコルが詳述されている:カップリングアッセイ、ETCとOXPHOS機構との間の結合の程度を評価するためのCA;電子フローアッセイにより、個々のETC錯体の活性を測定するEFA;BOXアッセイにより、ミトコンドリアβ酸化能を決定した。特に、従来の呼吸法と比較して、少量のサンプルしか必要としません。ここで使用される分離プロトコルは、他の場所で公開されている方法から変更されています18。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリア呼吸を研究するために使用されるすべての方法には限界があります。したがって、特定の実験的な質問に最も適した方法を選択することが重要です。この研究は、ミトコンドリア機能を調査するためにさまざまな呼吸アッセイを実行するために、マウス骨格筋からミトコンドリアを単離するための最新かつ詳細なプロトコルを提供する。実際、マイクロプレートベースの技術?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ホモジナイザーとCABDプロテオミクスおよび畜産施設を技術サポートに使用してくれたJuan J. Tenaに感謝します。この研究は、スペイン教育文化スポーツ省のJ.D.H.へのフェローシップFPU16/03264、C.V.-G.へのフェローシップ助成金#22450、制度助成金MDM-2016-0687(CABDの遺伝子規制および形態形成省マリア・デ・マエズトゥ・エクセレンス・ユニット)、BFU2017-83150-PからJ.J..Cへのフェローシップ・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー協会(AFM)を通じて支援されまし.C。アンダルシア暫定軍事政権はP18-RT-4572、欧州連合(EU)のFEDER資金提供プログラム、スペイン科学・イノベーション・大学省はRED2018-102576-TをPNに助成金を支給しています。
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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