Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Zusammenfassung

Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.

Zusammenfassung

Hier berichten wir über selektive In-vitro-Modelle von Schaltkreisen, die auf Glia-Schaltkreisen (Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia) und/oder Neuronen aus peripheren (dorsale Wurzelganglien) und zentralen Geweben (Kortex, subventrikuläre Zone, Organoid) basieren, die dynamisch in Bezug auf Kalziumverschiebungen untersucht werden. Das Modell, das zur Veranschaulichung der Ergebnisse gewählt wurde, ist die Netzhaut, ein einfaches Gewebe mit komplexen zellulären Interaktionen. Kalzium ist ein universeller Botenstoff, der an den meisten wichtigen zellulären Rollen beteiligt ist. Wir erklären in einem Schritt-für-Schritt-Protokoll, wie retinale Neuron-Gliazellen in Kultur vorbereitet und ausgewertet werden können, wobei wir uns Kalziumverschiebungen vorstellen. In diesem Modell unterscheiden wir Neuronen von Glia basierend auf ihrer selektiven Reaktion auf KCl und ATP. Kalziumpermeable Rezeptoren und Kanäle werden selektiv in verschiedenen Kompartimenten exprimiert. Um Kalziumreaktionen zu analysieren, verwenden wir ratiometrische fluoreszierende Matrizen wie Fura-2. Diese Sonde quantifiziert die freie Ca2+-Konzentration basierend auf Ca2+-freien und ^Ca2+-gebundenen Formen und zeigt zwei verschiedene Peaks, die auf der Fluoreszenzintensität basieren, die auf zwei Wellenlängen wahrgenommen wird.

Einleitung

Aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als zweiter Botenstoff ist dieses Ion an einer Vielzahl von Signalaktivitäten beteiligt: Gentranskription, Geburt und Tod, Proliferation, Migration und Differenzierung, synaptische Übertragung und Plastizität. Daher würde eine Methode, die in der Lage ist, die Dynamik der Kalziumaktivierung mit Genauigkeit und Beweglichkeit zu verfolgen, eine Möglichkeit bieten, einzigartige räumlich-zeitliche Reaktionen zu beobachten. Eine solche Methode ist die zelluläre Kalzium-Bildgebungstechnik, die funktionelle Daten mit spezifischen Zellphänotypen korreliert, basierend auf ihren unterschiedlichen Reaktionen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Federal University of Rio de Janeiro nach den "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, USA) genehmigt und durchgeführt. Genehmigungsnummer IBCCF-035 für befruchtete Hühnereier aus Weißem Leghorn.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Krebslösung vorbereiten: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 6 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
2. Salzpuffer (^Ca2+ und ^Mg2+ freie Lösung - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2....

Ergebnisse

Hier verwendeten wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken am 8. Tag, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren. Kulturen wurden im Wesentlichen wie ^{beschrieben15,19} als gemischte Neuron-Gliazellen (bei einer Dichte von ≥ 1 x ¹⁰⁶ Zelle/Schale) in einem Stadium von 7 Tagen in vitro hergestellt (Abbildung 1A). Alternativ können angereicherte neuronale Zellen, die in nie.......

Diskussion

Wir haben das Netzhautgewebe verwendet, um zu zeigen, dass Kalziumreaktionen, die durch KCl oder ATP vermittelt werden, eindeutig in neuronale bzw. gliale Reaktionen unterteilt sind (Abbildung 1). Obwohl einige Daten in der Literatur darauf hindeuten, dass P2X7-Rezeptoren in Neuronen exprimiert werden, die die neuronale Aktivität und die freisetzung synaptischer Neurotransmitter ^regulieren20, stellen andere Autoren die Existenz neuronaler P2X7-Rezeptoren in Frage. Tat.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mm Deckglas	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Zellunterstützung
510 nm Langpassfilter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Ergänzung	Gibco	17504044	Ergänzung
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digital Kamera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glukose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Zellkulturmedium
Excel Software	Microsoft
Fötales Kälberserum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluoreszenzmikroskop	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molekulare Sonden	F1221	Ratiometrisch Ca2+ Indikator
Gentamicin Sulfat	Calbiochem	1405-41-0	Antibiotika
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 Gerät	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminin	Gibco	23017-015	Hilfe Zelladhäsion
Metafluor Software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 Plattform	Warner Instruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	nichtionisch, Tensid
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P8920	Hilfe bei der Zelladhäsion
Trypsin-EDTA 0,25%	Gibco	25200056	Dissoziationsenzym