Stereotoksisk kirurgisk tilnærming til mikroinjekt Caudal Brainstem og Øvre Cervical Ryggmarg via Cisterna Magna i mus

Summary

Stereotoksisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus innebærer vanligvis tilgang gjennom skallebenene og styres av hodeskallelandemerker. Her skisserer vi en alternativ stereotaxisk tilnærming for å målrette kaudal hjernestamme og øvre cervical ryggmarg via cisterna magna som er avhengig av direkte visualisering av brainstem landemerker.

Abstract

Stereotoksisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus styres ofte av hodeskallelandemerker. Tilgang oppnås deretter via burrhull boret gjennom skallen. Denne standardtilnærmingen kan være utfordrende for mål i kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning på grunn av spesifikke anatomiske utfordringer, da disse stedene er fjernt fra hodeskallelandemerker, noe som fører til upresise. Her skisserer vi en alternativ stereotaxisk tilnærming via cisterna magna som har blitt brukt til å målrette diskrete regioner av interesse for kaudal hjernestamme og øvre cervical ledning. Cisterna magna strekker seg fra occipital bein til atlaset (dvs. det andre vertebrale beinet), er fylt med cerebrospinalvæske, og er dekket av dura mater. Denne tilnærmingen gir en reproduserbar vei for tilgang til utvalgte sentralnervesystem (CNS) strukturer som ellers er vanskelig å nå på grunn av anatomiske barrierer. Videre gir det mulighet for direkte visualisering av brainstem landemerker i nærheten av målstedene, noe som øker nøyaktigheten når du leverer små injeksjonsvolumer til begrensede interesseområder i kaudal hjernestamme og øvre livmorhalsledning. Til slutt gir denne tilnærmingen en mulighet til å unngå cerebellum, noe som kan være viktig for motoriske og sensoriske studier.

Introduction

Standard stereotaxisk kirurgi for å målrette hjernesteder hos mus¹ innebærer vanligvis fiksering av skallen ved hjelp av et sett med ørestenger og en munnstang. Koordinater estimeres deretter basert på referanseatlaser ^2,3, og hodeskalle landemerker, nemlig bregma (punktet der suturene i frontal og parietal bein kommer sammen) eller lambda (punktet der suturene i parietal og occipital bein kommer sammen; Figur 1A,B). Gjennom et burrhull inn i skallen over det estimerte målet, kan målområdet nås, enten for levering av mikroinjeksjoner eller instrumentering med kanyler eller optiske fibre. På grunn av variasjon i anatomien til disse suturene og feilene i lokaliseringen av bregma eller lambda ^4,5, varierer posisjonen til nullpunkter i forhold til hjernen fra dyr til dyr. Selv om små feil i målretting, som følge av denne variasjonen, ikke er et problem for store eller nærliggende mål, er deres innvirkning større for mindre interesseområder som er fjernt fra nullpunktene i anteroposterior eller dorsoventral fly og / eller når de studerer dyr av varierende størrelse på grunn av alder, belastning og / eller kjønn. Det er flere ekstra utfordringer som er unike for medulla oblongata og øvre livmorhalsledning. For det første er små endringer i anteroposteriorkoordinater forbundet med betydelige endringer i dorsoventralkoordinater i forhold til dura, på grunn av cerebellumets posisjon og form (figur 1Bi)^2,6,7. For det andre er den øvre livmorhalsledningen ikke inneholdt i skallen². For det tredje gjør den skråstillingen til oksipitalt bein og overliggende lag av nakkemuskler² standard stereotaxisk tilnærming enda mer utfordrende for strukturer som ligger nær overgangen mellom hjernestammen og ryggmargen (figur 1Bi). Til slutt er mange mål av interesse for kaudal hjernestamme og livmorhalsledning liten², noe som krever presise og reproduserbare injeksjoner ^8,9.

En alternativ tilnærming gjennom cisterna magna omgår disse problemene. Cisternamagnaten er et stort rom som strekker seg fra oksipitalbenet til atlaset (figur 1A, dvs. det andre vertebrale beinet)¹⁰. Den er fylt med cerebrospinalvæske og dekket av dura mater¹⁰. Dette rommet mellom occipitalbenet og atlaset åpnes når anteroflexing hodet. Det kan nås ved å navigere mellom de overliggende parrede magene i longus capitis-muskelen, og utsette dorsaloverflaten til kaudal hjernestamme. Regioner av interesse kan da målrettes basert på landemerkene i disse regionene selv hvis de ligger nær dorsaloverflaten; eller ved å bruke obex, punktet der den sentrale kanalen åpner inn i IV ventrikelen, som et nullpunkt for koordinater for å nå dypere strukturer. Denne tilnærmingen har blitt brukt i en rekke arter, inkludert rotte¹¹, katt¹², mus ^8,9 og ikke-menneskelig primat¹³ for å målrette den ventrale respiratoriske gruppen, medullær medial retikulær formasjon, kjernen i den ensomme kanalen, området postrema eller hypoglossale kjernen. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke mye brukt, da den krever kunnskap om anatomi, et spesialisert verktøysett og mer avanserte kirurgiske ferdigheter sammenlignet med standard stereotakaxisk tilnærming.

Her beskriver vi en trinnvis kirurgisk tilnærming for å nå hjernestammen og øvre livmorhalssnor via cisternamagnaten, visualisere landemerker, sette nullpunktet (figur 2) og estimere og optimalisere målkoordinater for stereotoksisk levering av mikroinjeksjoner i de diskrete hjernestamme- og ryggmargsregionene av interesse (figur 3). Vi diskuterer deretter fordelene og ulempene knyttet til denne tilnærmingen.

Protocol

Forfatteren erklærer at protokollen følger retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved Beth Israel Deaconess Medical Center. 1. Fremstilling av kirurgiske instrumenter og stereotaxisk ramme MERK: Operasjonen utføres under aseptiske forhold. Steriliteten opprettholdes ved hjelp av den sterile spissteknikken. Monter den stereotaktiske armen med en mikropipette eller sprøyte fylt med en injiserbar valgbar (adeno-as…

Representative Results

Cisterna magna tilnærming gjør det mulig å målrette caudal hjernestamme og øvre Cervical ledning strukturer som ellers er vanskelig å nå via standard stereotaxic tilnærminger eller er utsatt for inkonsekvent målretting. Operasjonen for å nå cisterna magna krever snitt i huden, et tynt lag av trapesmuskel og åpning av dura mater og tolereres derfor godt av mus. Det er spesielt effektivt og mindre invasivt når man målretter mot flere (langsgående spredte eller bilaterale) steder, da det ikke krever …

Discussion

Standard stereotaxic kirurgi er vanligvis avhengig av hodeskalle landemerker for å beregne koordinatene til målsteder i CNS¹. Målsteder nås deretter via burrhull som bores gjennom skallen¹. Denne metoden er ikke ideell for kaudal hjernestamme, da målsteder ligger fjernt fra skallen landemerker i anteroposterior og dorsoventral fly² og som anatomien til skallen og overliggende muskler gjør tilgang utfordrende⁶ (<…

Materials

Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window