Stereotaxisk kirurgisk metod för att mikroinjektera den kaudala hjärnstammen och övre cervikala ryggmärgen via Cisterna Magna hos möss
Summary
Stereotaxisk kirurgi för att rikta hjärnplatser hos möss innebär vanligtvis åtkomst genom skallbenen och styrs av skalle landmärken. Här skisserar vi ett alternativt stereotaxiskt tillvägagångssätt för att rikta in sig på den kaudala hjärnstammen och övre cervikala ryggmärgen via cisterna magna som bygger på direkt visualisering av hjärnstammens landmärken.
Abstract
Stereotaxisk kirurgi för att rikta hjärnplatser hos möss styrs vanligtvis av skalle landmärken. Åtkomst erhålls sedan via burrhål borrade genom skallen. Detta standardtillvägagångssätt kan vara utmanande för mål i den kaudala hjärnstammen och den övre livmoderhalsen på grund av specifika anatomiska utmaningar eftersom dessa platser är avlägsna från skalle landmärken, vilket leder till oprecision. Här beskriver vi ett alternativt stereotaxiskt tillvägagångssätt via cisterna magna som har använts för att rikta in sig på diskreta regioner av intresse för den kaudala hjärnstammen och den övre livmoderhalsen. Cisterna magna sträcker sig från det occipitala benet till atlasen (dvs det andra ryggradsbenet), är fylld med cerebrospinalvätska och är täckt av dura mater. Detta tillvägagångssätt ger en reproducerbar åtkomstväg till utvalda strukturer i centrala nervsystemet (CNS) som annars är svåra att nå på grund av anatomiska barriärer. Dessutom möjliggör det direkt visualisering av hjärnstammens landmärken i närheten av målplatserna, vilket ökar noggrannheten när man levererar små injektionsvolymer till begränsade regioner av intresse för den kaudala hjärnstammen och den övre livmoderhalsen. Slutligen ger detta tillvägagångssätt en möjlighet att undvika cerebellum, vilket kan vara viktigt för motoriska och sensorimotoriska studier.
Introduction
Standard stereotaxisk kirurgi för att rikta hjärnplatser hos möss1 innebär vanligtvis fixering av skallen med hjälp av en uppsättning öronstänger och en munstång. Koordinaterna uppskattas sedan baserat på referensatlaser 2,3 och skalle landmärken, nämligen bregma (den punkt där suturerna i front- och parietalbenen kommer ihop) eller lambda (den punkt där suturerna i parietala och occipitala ben kommer ihop; Figur 1A,B). Genom ett burrhål i skallen ovanför det uppskattade målet kan målområdet sedan nås, antingen för leverans av mikroinjektioner eller instrumentering med kanyler eller optiska fibrer. På grund av variation i anatomin hos dessa suturer och fel i lokaliseringen av bregma eller lambda 4,5 varierar positionen för nollpunkter i förhållande till hjärnan från djur till djur. Även om små fel i inriktningen, som beror på denna variation, inte är ett problem för stora eller närliggande mål, är deras inverkan större för mindre intresseområden som är avlägsna från nollpunkterna i anteroposterior eller dorsoventralplan och / eller när man studerar djur av varierande storlek på grund av ålder, belastning och / eller kön. Det finns flera ytterligare utmaningar som är unika för medulla oblongata och den övre livmoderhalsen. För det första är små förändringar i anteroposteriorkoordinater associerade med signifikanta förändringar i dorsoventrala koordinater i förhållande till dura, på grund av cerebellumets position och form (figur 1Bi)2,6,7. För det andra finns inte den övre livmoderhalsen i skallen2. För det tredje gör den sneda positionen för det occipitala benet och det överlagrande skiktet av nackmusklerna2 det vanliga stereotaxiska tillvägagångssättet ännu mer utmanande för strukturer som ligger nära övergången mellan hjärnstammen och ryggmärgen (Figur 1Bi). Slutligen är många mål av intresse för den kaudala hjärnstammen och livmoderhalsen små2, vilket kräver exakta och reproducerbara injektioner 8,9.
Ett alternativt tillvägagångssätt genom cisterna magna kringgår dessa problem. Cisterna magna är ett stort utrymme som sträcker sig från det occipitala benet till atlasen (figur 1A, dvs det andra ryggradsbenet)10. Den är fylld med cerebrospinalvätska och täckt av dura mater10. Detta utrymme mellan det occipitala benet och atlasen öppnas när anteroflexing huvudet. Det kan nås genom att navigera mellan de överlagda parade magarna i longus capitis-muskeln, vilket exponerar dorsalytan på den kaudala hjärnstammen. Regioner av intresse kan sedan riktas mot landmärkena i dessa regioner själva om de ligger nära dorsalytan; eller genom att använda obex, den punkt där den centrala kanalen öppnar sig i IV-ventrikeln, som en nollpunkt för koordinater att nå djupare strukturer. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts i en mängd olika arter, inklusive råtta11, katt12, mus 8,9 och icke-mänsklig primat13 för att rikta in sig på den ventrala andningsgruppen, medullär medial retikulär bildning, kärnan i det ensamma området, områdespostrema eller hypoglossal kärna. Detta tillvägagångssätt används emellertid inte i stor utsträckning eftersom det kräver kunskap om anatomi, en specialiserad verktygslåda och mer avancerade kirurgiska färdigheter jämfört med det vanliga stereotaxiska tillvägagångssättet.
Här beskriver vi ett steg-för-steg-kirurgiskt tillvägagångssätt för att nå hjärnstammen och övre livmoderhalsen via cisterna magna, visualisera landmärken, ställa in nollpunkten (figur 2) och uppskatta och optimera målkoordinater för stereotaxisk leverans av mikroinjektioner i de diskreta hjärnstammen och ryggmärgsregionerna av intresse (Figur 3). Vi diskuterar sedan fördelarna och nackdelarna med detta tillvägagångssätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standard stereotaxisk kirurgi förlitar sig vanligtvis på skalle landmärken för att beräkna koordinaterna för målplatser i CNS1. Målplatser nås sedan via burrhål som borras genom skallen1. Denna metod är inte idealisk för den kaudala hjärnstammen eftersom målplatserna ligger långt ifrån skallens landmärken i anteroposterior och dorsoventrala plan2 och eftersom anatomin hos skallen och överliggande muskler gör åtkomst utman…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av R01 NS079623, P01 HL149630 och P01 HL095491.
Materials
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
