Terapeutisk evaluering af fækal mikrobiotatransplantation i en Interleukin 10-mangelfuld musemodel

Summary

Samspillet mellem genetisk modtagelighed, slimhindeimmunitet og intestinalt mikroøkologisk miljø er involveret i patogenesen af inflammatorisk tarmsygdom (IBD). I denne undersøgelse anvendte vi fækal mikrobiotatransplantation til IL-10-mangelfulde mus og undersøgte dens indvirkning på tyktarmsbetændelse og hjertefunktion.

Abstract

Med udviklingen af mikroøkologi i de senere år har forholdet mellem tarmbakterier og inflammatorisk tarmsygdom (IBD) tiltrukket sig stor opmærksomhed. Akkumulerende beviser tyder på, at dysbiotisk mikrobiota spiller en aktiv rolle i at udløse eller forværre den inflammatoriske proces i IBD, og at fækal mikrobiotatransplantation (FMT) er en attraktiv terapeutisk strategi, da overførsel af en sund mikrobiota til IBD-patient kunne genoprette den passende værtsmikrobiotakommunikation. De molekylære mekanismer er imidlertid uklare, og effektiviteten af FMT har ikke været særlig veletableret. Der er således behov for yderligere undersøgelser i dyremodeller af IBD. I denne metode anvendte vi FMT fra vildtype C57BL/6J mus til IL-10 mangelfulde mus, en meget anvendt musemodel af colitis. Undersøgelsen uddyber indsamling af fækale pellets fra donormusene, fremstilling af fækal opløsning / suspension, administration af fækalopløsningen og overvågning af sygdommen. Vi fandt ud af, at FMT signifikant afbødede hjerteforringelsen hos IL-10 knockout-mus, hvilket understregede dets terapeutiske potentiale for IBD-styring.

Introduction

Det menneskelige intestinale mikroøkosystem er ekstremt komplekst, med mere end 1000 arter af bakterier i tarmen hos en sund person¹. Tarmfloraen er involveret i at opretholde tarmens og immunresponsets normale fysiologiske funktioner og har et uadskilleligt forhold til menneskekroppen. Akkumulerende beviser tyder på, at tarmmikrobiomet udgør det sidste menneskelige organ, som er en del af menneskekroppen, ikke kun en gruppe parasitter². Et ‘sundt’ symbiotisk forhold mellem tarmmikrobiotaen, deres metabolitter og værtsimmunsystemet, der blev etableret tidligt i livet, er afgørende for at opretholde tarmhomeostase. I nogle unormale tilstande som kronisk betændelse forstyrrer ændringer i kroppens indre og ydre miljø alvorligt tarmhomeostasen, hvilket resulterer i en vedvarende ubalance i tarmens mikrobielle samfund, kaldet dysbiose³. Faktisk kan eksponering for flere miljøfaktorer, herunder kost, medicin og patogener, føre til ændringer i mikrobiotaen.

Dysbiose er forbundet med patogenesen af en række tarmsygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD), irritabel tarmsyndrom (IBS) og pseudomembranøs enteritis samt en voksende liste over ekstra-tarmlidelser, herunder hjerte-kar-sygdomme, fedme og allergi⁴. Mikrobiotaprofilering afslørede, at patienter med IBD har et dramatisk fald i bakteriel mangfoldighed samt markante ændringer i populationerne af nogle specifikke bakteriestammer ^5,6. Disse undersøgelser viste mindre Lachnospiraceae og Bacteroidetes, men flere Proteobacteria og Actinobacteria hos IBD-patienter. Det antages, at patogenesen af IBD er relateret til forskellige patogene faktorer, herunder unormal tarmflora, dysreguleret immunrespons, miljømæssige udfordringer og genetiske varianter⁷. Rigelige beviser tyder på, at tarmbakterier spiller en rolle i initierings- og påføringsfaserne af IBD^8,9, hvilket indikerer^, at korrigering af tarmdysbiose kan repræsentere en ny tilgang til behandling og / eller vedligeholdelsesbehandling af IBD.

Prototypen af fækal mikrobiotatransplantation (FMT) begyndte i det gamle Kina¹⁰. I 1958 behandlede Dr. Eiseman og hans kolleger med succes fire tilfælde af alvorlig pseudomembranøs enteritis med fækalt stof fra raske donorer via enema og åbnede et nyt kapitel i moderne vestlig medicin ved hjælp af menneskelig afføring til behandling af menneskelige sygdomme¹¹. Clostridium difficile infektion (CDI) har vist sig at være hovedårsagen til pseudomembranøs enteritis¹² , og FMT er yderst effektiv til behandling af CDI. I de sidste otte år er FMT blevet en standardbehandling til behandling af tilbagevendende CDI¹³, hvilket har givet anledning til yderligere undersøgelser, der undersøger FMT’s rolle i andre lidelser, såsom IBD. I løbet af de sidste tyve år har adskillige caserapporter og kohortestudier dokumenteret brugen af FMT hos patienter med IBD¹⁴. En metaanalyse, herunder 12 forsøg, viste, at 62% af patienterne med Crohns sygdom (CD) opnåede klinisk remission efter FMT, og 69% af CD-patienterne havde klinisk respons¹⁵. På trods af disse opmuntrende resultater er FMT’s rolle i håndteringen af IBD fortsat usikker, og de mekanismer, hvormed FMT forbedrer tarmbetændelse, er dårligt forstået. Yderligere undersøgelser er nødvendige, før FMT kan tilslutte sig det nuværende armamentarium af behandlingsmuligheder for IBD i klinikkerne.

I denne protokol anvendte vi FMT på IL-10-^/- mus, som udvikler colitis spontant efter fravænning og har fungeret som en guldstandard for at afspejle den multifaktorielle karakter af IBD^16,17,18. IL-10^−/− mus er i vid udstrækning blevet brugt til at dissekere IBD-ætiologi, fordi de præsenterer lignende molekylære og histologiske træk som IBD-patienter, og ligesom patienter kan sygdommen forbedres med anti-TNFα-terapi¹⁶. Aldrende IL10−^/− mus (>9 måneder) har en øget hjertestørrelse og nedsat hjertefunktion sammenlignet med aldersmatchede vildtypemus¹⁹, hvilket gør det til en fremragende model til undersøgelse af colitis-inducerede hjertesygdomme. Imidlertid kan andre murinmodeller af colitis, såsom dextrannatriumsulfatmodellen og T-celleinduceret colitis-model, også anvendes. Vi administrerede fækal suspension via oral sonde, vist sig at være en effektiv og bedre rute end enema hos mennesker²⁰.

Protocol

Alle procedurer udført på dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Medical Branch i Galveston (protokol # 1512071A). 1. Indsamling af friske fækale pellets Forbered sterile papirhåndklæder, stump-ende tang og 50 ml koniske rør.Læg nogle papirhåndklæder og tang i separate autoklaveposer og autoklave dem ved 180 °C i tør varme i 30 min. Brug også sterile koniske rør. Vej de koniske rør og skriv deres…

Representative Results

Vi udførte sund donor FMT 3 gange (en gang om måneden i 3 måneder) på 2 måneder gamle C57BL / 6J vildtype (WT) og IL-10 knockout mus. Aldersmatchede C57BL/6J-mus (aldersforskellen skal være <2 måneder) fungerede som fækale donorer, og der blev brugt friske fækale pellets hver gang. VVM-analyser afslørede, at BNP var markant forhøjet i plasmaet hos IL-10-mangelmus, og at sund donor-FMT signifikant afbødede stigningen i BNP-niveauer (figur 1A, n = 5, p < 0,05). Ekkokardiog…

Discussion

Som en innovativ undersøgelsesbehandling er FMT blevet et varmt emne i behandlingen af forskellige lidelser i de senere år, da dysbiose af den kommensale mikrobiota er impliceret i patogenesen af flere menneskelige sygdomme, herunder IBD, fedme, diabetes mellitus, autisme, hjertesygdomme og kræft²⁶. Selvom mekanismen ikke er bestemt, menes det, at FMT virker ved at opbygge en ny biologisk flora og forhindre tab af resterende bakterier. Den metode, der præsenteres heri, vedtog oral sonde som le…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA