Lokomotorisk bedömning av 6-hydroxydopamininducerad vuxen zebrafiskbaserad Parkinsons sjukdomsmodell

Summary

Det föreliggande protokollet beskriver intracerebroventrikulär (ICV) injektion av vuxna zebrafiskar med neurotoxisk 6-hydroxigopamin (6-OHDA) vid ventral diencephalon (Dn) och bedömningen av försämringen och efterföljande återhämtning av simbeteendepostlesion genom att använda det öppna tanktestet, som åtföljs av analys med hjälp av en videospårningsprogramvara.

Abstract

Begränsningarna av nuvarande behandlingar för att fördröja dopaminerg neuronal förlust vid Parkinsons sjukdom (PD) ökar behovet av alternativa terapier som kan återställa dessa neuroner. Mycket ansträngning riktas för närvarande mot en bättre förståelse av neuroregeneration med hjälp av prekliniska in vivo-modeller . Denna regenerativa förmåga till självreparation är dock ineffektiv hos däggdjur. Icke-däggdjursdjur som zebrafisk har således framträtt som en utmärkt neuroregenerativ modell på grund av dess förmåga att kontinuerligt självförnya och ha en nära hjärnhomologi till människor. Som en del av ansträngningen att belysa cellulära händelser som är involverade i neuroregenerering in vivo har vi etablerat den 6-hydroxydopamin (6-OHDA) -inducerade vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Detta uppnåddes genom den optimerade intracerebroventrikulära (ICV) mikroinjektionen av 99,96 mM 6-OHDA för att specifikt ablate dopaminerga neuroner (DpN) i ventral diencephalon (Dn) i zebrafiskhjärnan. Immunofluorescens indikerade mer än 85 % av DpN-ablationen vid dag tre efter förlossningen och fullständigt återställande av DpN vid lesionsstället 30 dagar efter förlossningen. Den föreliggande studien bestämde försämringen och efterföljande återhämtning av zebrafiskens simbeteende efter lesion genom att använda det öppna fälttestet genom vilket två parametrar, körd sträcka (cm) och medelhastighet (cm / s), kvantifierades. Förflyttningen bedömdes genom att analysera inspelningarna av enskilda fiskar i varje grupp (n = 6) med hjälp av videospårningsprogramvara. Resultaten visade en signifikant (p < 0,0001) minskning av hastighet (cm / s) och körd sträcka (cm) för lesionerad zebrafisk 3 dagar efter 3 dagar efter sham. Den lesionerade zebrafisken uppvisade full återhämtning av simbeteende 30 dagar efter böjningen. De nuvarande resultaten tyder på att 6-OHDA-lesionerad vuxen zebrafisk är en utmärkt modell med reproducerbar kvalitet för att underlätta studien av neuroregeneration i PD. Framtida studier om mekanismerna bakom neuroregenerering samt inneboende och yttre faktorer som modulerar processen kan ge viktig inblick i nya strategier för cellersättningsbehandling mot PD.

Introduction

Parkinsons sjukdom (PD), en sjukdom som tydligt kännetecknas av muskelstyvhet, vilande tremor och bradykinesi, är den snabbast växande neurologiska sjukdomen i ^världen1,2. Risken och förekomsten av PD ökar snabbt med åldern, särskilt hos individer i åldern 50 år och ^äldre3. Etiologin och patogenesen av PD hittills är fortfarande dåligt förstådd. Detta har ofta lämnat den tidiga starten av PD odiagnostiserad. För närvarande är bristen på dopamin och förlusten av dopaminerga nervceller (DpN) hos PD-patienter starkt kopplade till manifestationen av motoriska ^symtom4. Genom att dra nytta av detta förhållande har flera behandlingar utformats antingen för att fungera direkt som dopaminersättning (dvs. levodopa) eller för att kompensera för förlusten av DpN (dvs. djup hjärnstimulering). Även om dessa behandlingar medför symtomatiska fördelar, ändrar de inte sjukdomsförloppets försämrade ^förlopp5. Mot bakgrund av denna betydande svaghet har cellersättningsterapi föreslagits. Effekten av detta tillvägagångssätt är emellertid inkonsekvent med tanke på utmaningarna med transplantatberedning, celltillväxtkontroll och fenotypinstabilitet. Cellersättningsterapi, som hade väckt etiska problem, utgör också risken för att inducera hjärntumörer och oönskade ^{immunreaktioner6,7}.

Begränsningarna i nuvarande terapeutiska strategier har lett till en större tonvikt på regenerering av DpN som ett potentiellt tillvägagångssätt vid behandling av PD. Regenerering av DpN eller neuroregeneration har framstått som ett av de lovande genombrotten i hanteringen av PD, inte bara på grund av dess potential som en ny terapeutisk metod utan också som medel för att förstå sjukdomsmekanismen8^{, 9}. Detta tillvägagångssätt fokuserar på återställande av neuronal funktion genom differentiering, migration och integration av befintliga stamceller i de lesionerade ^kretsarna10. För att ytterligare utforska neuroregeneration har olika in vivo-studier genomförts. Det visade sig att ryggradsdjur som däggdjur, amfibier och reptiler genererar nya hjärnceller efter ^skada11,12. Bland ryggradsdjuren är däggdjursdjur mer eftertraktade med tanke på deras genetiska likhet med människor. Däggdjur uppvisar dock begränsad och dålig reparativ kapacitet i centrala nervsystemet (CNS) som kan pågå genom vuxen ålder efter en ^{hjärnskada13}. I allmänhet är däggdjur olämpliga som djurmodeller för att förstå neuroregenerering med tanke på att det låga antalet neuroner som produceras inte kommer att vara tillräckligt för att återställa skadade neurala kretsar som observerats vid PD. Som sådan är den teleostbaserade modellen, särskilt i zebrafisk, mycket gynnad för sin höga proliferativa hastighet, förmåga att kontinuerligt självförnya och stänga hjärnhomologi med ^{människor14,15}.

Zebrafisk används oftast för att studera oordnad rörelse i ^PD16. Den zebrafiskbaserade PD-modellen induceras vanligtvis av neurotoxiner, som inkluderar 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) och 6-hydroxydopamin (6-OHDA)¹⁷. Även om det är effektivt för att inducera specifik förlust av DpN och minskning av dopaminnivåer, efterliknar MPTP-baserade modeller inte nära villkoren för PD eftersom DpN-förlusten inte är begränsad enbart till ^CNS18. Oförmågan hos 6-OHDA att passera blod-hjärnbarriären begränsade dess effekter på cellulära och funktionella förändringar i hjärnan när det administreras intrakraniellt i motsats till ^{intramuskulärt19}. Perifer administrering av 6-OHDA orsakade en global minskning av dopaminnivåerna i hela ^{nervsystemet20}. Medan administrering av 6-OHDA i cerebrospinalvätskan orsakade ablation av DpN i hela ^CNS21, vilket inte efterliknar tillståndet som ses i PD varigenom förlusten av DpN uppträder specifikt vid substantia nigra i den mänskliga hjärnan. ICV-administrering av 6-OHDA, tvärtom, inducerade specifikt signifikant ablation av DpN i området ventral Dn i zebrafiskhjärnan, som liknade substantia ^nigra22. Intressant nog rapporterades återhämtning av DpN 30 dagar efter 6-OHDA-inducerad lesion och dessa neuroner överlevde under ^livet23,24. Den funktionella återhämtningen av DpN demonstrerades genom en lokomotorisk bedömning av tillryggalagd sträcka (cm) och medelhastighet (cm/s) med användning av den 6-OHDA-inducerade vuxna zebrafiskbaserade ^{PD-modellen22}.

Protocol

Den föreliggande studien har godkänts av kommittén för djurforskning och etik (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referensnr: UiTM CARE 346/2021, daterad den 7 maj 2021]. OBS: De publicerade protokollen22,25,26 för standardhållning och underhåll av den 6-OHDA-lesionerade vuxna zebrafisken PD-modellen användes. Experiment utfördes med vuxna manliga zebrafiskar (Danio rerio) i ?…

Representative Results

Det föreliggande experimentet bedömde förändringarna i vuxna zebrafiskars simbeteende efter ICV-mikroinjektion med 6-OHDA. Anledningen till att använda 6-OHDA som det valda neurotoxinet berodde på dess oförmåga att korsa blod-hjärnbarriären, vilket gav specifik och riktad ablation av DpN inom området intresse-ventral diencephalon (Dn)16. DpN-delpopulationen har här anatomisk likhet med DpN-delpopulationen i människans substantia nigra pars compacta31. <p cl…

Discussion

Det aktuella arbetet visade framgångsrikt den lokomotoriska bedömningen av den etablerade 6-OHDA-inducerade, vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Hela experimentet involverade tre huvudsteg: pre-ICV mikroinjektionspreparat, ICV-mikroinjektion av zebrafisk och lokomotorisk bedömning. För att säkerställa en hälsosam återhämtning av vuxna zebrafiskar efter ICV-mikroinjektionsförfarandet och goda experimentella resultat har vissa goda metoder för varje steg rekommenderats i den aktuella studien.

<p class="jove…

Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	–	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100