نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التعبير غير المتجانس عن connexins و innexins في بويضات Xenopus هو نهج قوي لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية لتقاطعات الفجوة (GJs). ومع ذلك ، فإن هذا النهج يمثل تحديا تقنيا لأنه يتطلب مشبك جهد تفاضلي لبويضتين متعارضتين تتشاركان أرضية مشتركة. على الرغم من أن عددا صغيرا من المختبرات قد نجح في تنفيذ هذه التقنية ، إلا أن جميعها استخدمت بشكل أساسي إما مكبرات صوت محلية الصنع أو مكبرات صوت تجارية تم تصميمها لتسجيل البويضة الواحدة. غالبا ما يكون من الصعب على المختبرات الأخرى تنفيذ هذه التقنية. على الرغم من أن وضع قياس التيار الجانبي العالي قد تم دمجه في مكبر صوت تجاري لتسجيلات الجهد المزدوج للبويضات المشبك ، إلا أنه لم يكن هناك تقرير عن تطبيقه حتى دراستنا الأخيرة. لقد جعلنا نهج قياس التيار الجانبي العالي أكثر عملية وملاءمة من خلال إدخال العديد من التعديلات التقنية ، بما في ذلك بناء منصة تسجيل قائمة على المغناطيسية تسمح بوضع البويضات والأقطاب الكهربائية المختلفة بدقة ، واستخدام محلول الحمام كموصل في الأقطاب الكهربائية التفاضلية للجهد ، واعتماد قطب KCl تجاري منخفض التسرب كقطب مرجعي ، تصنيع أقطاب التيار والجهد من الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق ، وتحديد مواقع جميع الأقطاب الكهربائية باستخدام الأجهزة القائمة على المغناطيسية. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتسجيلات مريحة وقوية للتيار الوصلة (Ij) بين بويضتين Xenopus متعارضتين.
المقدمة
GJs هي قنوات بين الخلايا قد تسمح بالتدفق الحالي وتبادل الجزيئات الخلوية الصغيرة بين الخلايا المجاورة. وهي موجودة في العديد من أنواع الخلايا وتؤدي وظائف فسيولوجية متنوعة. تتشكل GJs في الفقاريات بواسطة connexins ، في حين أن تلك الموجودة في اللافقاريات بواسطة innexins. يتكون كل GJ من قناتين نصفيتين متجاورين مع 6 أو 8 وحدات فرعية لكل نصف قناة ، اعتمادا على ما إذا كانت connexins أو innexins 1,2,3. لدى البشر 21 جينا كونيكسين4 ، في حين أن نماذج اللافقاريات الشائعة الاستخدام C. elegans و Drosophila melanogaster لديها 25 و 8 جينات innexin ، عل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم إجراء العمليات الجراحية وفقا لبروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات في كلية الطب بجامعة كونيتيكت.
1. جراحة الضفدع وإعداد البويضات منزوعة الجريبات
- تخدير أنثى ضفدع أفريقي مخالب بالغ (Xenopus laevis) (جدول المواد) عن طريق الانغماس في محلول تريكاين بارد (مع الثلج) (~ 300 ملغ / لتر).
- انتظر (~ 15 دقيقة) حتى يظهر الضفدع استجابة قليلة أو معدومة للضغط على قدميه الشبكيتين. ضع الضفدع على طاولة العمليات مع بطنه متجها لأعلى.
- بعد شق طولي (طوله 8-10 مم) في منطقة أسفل البطن اليسرى أو اليمنى ، اسحب بلطف قطعة صغيرة من أنسجة المبيض بزوج من الملقط ، وقطع أنسجة المبيض ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
UNC-7 و UNC-9 هما innexins من C. elegans. في حين أن UNC-9 يحتوي على شكل متساوي واحد فقط ، فإن UNC-7 لديه أشكال متساوية متعددة تختلف بشكل رئيسي في الطول وتسلسل الأحماض الأمينية للمحطات الأمينية 7,8. قد تشكل هذه الإنكسين GJs متجانسة وكذلك غير متجانسة (من UNC-7 و UNC-9) عند التعبير عنها في بويضات Xenopus 7,8. ويبين الشكل 3 آثار الممثل الأولJ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يبدو أن تحسين النظام ضروري لتجارب مشبك الجهد المزدوج للبويضة. بدونها ، يمكن أن تكون التسجيلات غير مستقرة للغاية ، وقد تضطر مكبرات الصوت إلى حقن كمية زائدة من التيار للوصول إلى Vm المستهدف ، مما يؤدي إلى تلف البويضات وفشل التسجيل. هناك عدة عوامل حاسمة للحصول على تسجيلات مستقرة للبويضة المزدوجة باستخدام طريقة قياس التيار الجانبي العالي. أولا ، يجب أن يكون للأقطاب الكهربائية الحالية والجهد مقاومة مناسبة (~ 1 MΩ) ، ويجب أن يكون حاملوها نظيفين. ثانيا ، يجب أن يكون للأقطاب الكهربائية VDIFF مقاومة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر هاينغ زان ، وتشيان جي على مشاركتهم في المرحلة الأولية من التطوير التقني ، وكيرانماي فيدانتهام للمساعدة في الأرقام ، والدكتور كاميلو بيراكيا على المشورة بشأن غرفة إقران البويضات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حامل مغناطيسي جسر أجار ALA | للأدوات العلمية | MPSALT-H | أكثر استقرارا من مشبك أنبوب Narishige نظرا لقاعدته المغناطيسية الأكبر ولكنه يتطلب تعديلا لتجميع مقبس أنثى 2 مم. |
| حاقن نانو لتر أوتوماتيكي | شركة دروموند العلمية ، برومول ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | حاقن نانو لتر آلي Nanoject II | |
| كولاجيناز ، النوع الثاني | Gibco-USA ، لانجلي ، حسنا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | ، هاتفيلد ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 62108-ST | |
| مسبار الجهد التفاضلي | Warner Instruments ، Hamden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية | 7255DI | |
| الجزيئية لمحول الإشارات التناظرية إلى الرقمية | ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | Digidata 1440A | |
| Dumont # 5 Tweezers | World Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 500341 | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية | Drummond Scientific Company ، Broomall ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 3-000-203-G / X | |
| الأسلاك الساخنة | Amazon.com | Proxxon 37080 | البديل هو هرقل 8500 DHWT ، الذي يحتوي على دواسة تحكم في القدم. |
| Hyaluronidase ، النوع I-S | MilliporeSigma ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | H3506 | |
| قاعدة حامل مغناطيسي | Kanetec USA Corp. ، Bensenville ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument ، Novاتو ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | BV-10 | |
| حامل القطب الكهربائي | الدقيق العالمي للأدوات الدقيقة ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | MEH1S15 | |
| مجتذب ماصات دقيقة | أداة سوتر ، نوفاتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | 438733 | شركة توريد مكونات شبكة النايلون Microwell |
| Minitray ، سبارتا ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | U-CMN-1000 | ||
| مضخم البويضات المشبك | وارنر الأدوات ، ، Hamden ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية | OriginPro | |
| OriginLab Corporation ، نورثهامبتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 2020b | ||
| pClamp | Molecular Devices ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | الإصدار 10 | |
| من الأدوات الدقيقة العالمية للقطب المرجعي | ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | DRIREF-2SH | المواصفات: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (مثبط الريبونوكلياز) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| خياطة الحرير 5-0 | Covidien ، نورث هافن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية | VS890 | |
| مقياس الطيف الضوئي NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| رقيق الجدار الزجاجي Capallaries | أدوات الدقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | TW150F-4 | |
| أنبوب المشبك | Narishige International USA ، Amityville ، NY ، USA | CAT-1 | جاهز للاستخدام ولكن موضعه عرضة للتحول بسبب القاعدة المغناطيسية الصغيرة. |
| Xenopus laevis< / em> | Xenopus Express ، بروكسفيل ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | IMP-XL-FM |
المراجع
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A reso....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
