여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제노푸스 난모세포에서 접합체와 이넥신의 이종성 발현은 갭 접합 (GJs)의 생물 물리학 적 특성을 연구하기위한 강력한 접근법입니다. 그러나이 접근법은 공통점을 공유하는 두 개의 대향하는 난모세포의 차동 전압 클램프가 필요하기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 소수의 실험실이이 기술을 성공적으로 수행했지만 본질적으로 모두 수제 증폭기 또는 단일 난모세포 녹음을 위해 설계된 상업용 증폭기를 사용했습니다. 다른 실험실에서이 기술을 구현하는 것은 종종 어렵습니다. 하이사이드 전류 측정 모드가 이중 난자 전압 클램프 기록을위한 상업용 증폭기에 통합되었지만 최근 연구까지 그 적용에 대한 보고서는 없었습니다. 우리는 난모세포 및 다양한 전극을 정밀하게 배치 할 수있는 자기 기반 기록 플랫폼 구축, 전압 차동 전극의 도체로서의 욕조 솔루션 사용, 상업용 저누설 KCl 전극을 기준 전극으로 채택하는 등 몇 가지 기술적 수정을 도입하여 하이 사이드 전류 측정 접근법을보다 실용적이고 편리하게 만들었습니다. 얇은 벽 유리 모세 혈관에서 전류 및 전압 전극을 제작하고 자기 기반 장치를 사용하여 모든 전극을 배치합니다. 여기에 설명 된 방법은 두 개의 대향하는 Xenopus 난자 사이의 접합 전류 (Ij)의 편리하고 강력한 기록을 가능하게합니다.
서론
GJ는 이웃 세포들 사이의 작은 세포질 분자의 전류 흐름 및 교환을 허용할 수 있는 세포간 채널이다. 그들은 많은 세포 유형에 존재하며 다양한 생리 기능을 수행합니다. 척추 동물의 GJ는 코넥신에 의해 형성되는 반면, 무척추 동물의 GJ는 이넥신에 의해 형성됩니다. 각 GJ는 이들이 연결관인지 또는 이넥신 1,2,3인지에 따라 반채널당 6개 또는 8개의 서브유닛을 갖는 두 개의 병치된 반채널로 구성된다. 인간은 21 개의 코넥신 유전자4를 가지고 있으며, 일반적으로 사용되는 무척추 동물 모델 C. elegans와 Drosophila melanogaster는 각각 25 및 8 개의 이넥신 유전자를 가지고 있으며 5,6 개가 있습니다. 유전자 전사체의 대안적인 스플라이싱은 적어도 이넥신 7,8에 대해 GJ 단백질의 다양성을 더욱 증가시킬 수 있다.<....
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프로토콜
수술은 코네티컷 의과 대학의 기관 동물 관리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행됩니다.
1. 개구리 수술 및 탈암 난모세포의 준비
- 성인 여성 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis) (재료 표)를 시원한 (얼음과 함께) 트리카인 용액 (~ 300 mg / L)에 담그고 마취하십시오.
- 개구리가 웹베드 발을 쥐어 짜는 것에 대한 반응이 거의 없거나 전혀 나타나지 않을 때까지 기다리십시오 (~ 15 분). 개구리를 배꼽을 위로 향하게하는 수술대에 놓습니다.
- 왼쪽 또는 오른쪽 하복부 부위에 세로 절개 (길이 8-10mm) 후 한 쌍의 포셉으로 작은 난소 조직을 부드럽게 꺼내고 한 쌍의 작은 가위로 난소 조직을 잘라냅니다.
- 즉시 유리 난소 조직을Ca2+-free ND96 용액 (NaCl 99 mM, KCl2 mM,MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5)에 담그고 60-mm 페트리 디쉬 안에 넣는다.
- 5-0 실크 봉합사 (재료 표)를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 절개를 닫은 후 개구리를 다시....
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결과
UNC-7과 UNC-9는 C. elegans의 이넥신입니다. UNC-9는 단 하나의 이소형만을 가지고 있지만, UNC-7은 아미노 말단 7,8의 길이와 아미노산 서열에서 주로 상이한 다중 이소형을 갖는다. 이들 이넥신은 제노푸스 난모세포 7,8에서 발현될 때 이형적(UNC-7 및 UNC-9의) GJs뿐만 아니라 동형적을 형성할 수 있다. UNC-7b 및 UNC-9 동형형 GJ의 대표적인 Ij 트레이스 및 생성된 정규화된 Gj-Vj 관계가 도 3에 도시되어 있다. 쌍을 이룬 난모세포를 사용한 이들 실험에서, 난모세포 1의 Vm은 유지.......
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토론
시스템 최적화는 이중 난모세포 전압 클램프 실험에 필요한 것으로 보입니다. 그것 없이는 기록이 매우 불안정 할 수 있으며 증폭기가 목표 Vm에 도달하기 위해 과도한 양의 전류를 주입해야 할 수 있으므로 난모세포 손상 및 기록 실패가 발생할 수 있습니다. 몇 가지 요인은 높은 측면 전류 측정 방법으로 안정적인 이중 난모세포 기록을 얻는 데 중요합니다. 첫째, 전류 및 전압 전극은 적절한 저항 (~ 1MΩ)을 가져야하며 홀더는 깨끗해야합니다. 둘째, VDIFF 전극은 낮은 저항 (<150kΩ)을 가져야하며 난모세포에 가깝습니다. 셋째, 동일한 난모세포에 대한 모든 전극 (전압, 전류 및 V DIFF)은 동일한 측면 (왼쪽 또는 오른쪽)에 위치해야하며 전극의 순서 (뒤에서 앞으로)는 전류, 전압 및 VDIFF이어야합니다. 마지막으로, 기준 전극은 사용자를 향해 35-mm 페트리 접시의 가장자리 근처에 위치해야 한.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
기술 개발의 초기 단계에 참여한 Haiying Zhan, Qian Ge, 수치를 도와 준 Kiranmayi Vedantham 및 난모세포 페어링 챔버에 대한 조언을 해준 Camillo Peracchia 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천 브리지 마그네틱 홀더 | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | : 마그네틱베이스가 더 크기 때문에 Narishige 튜브 클램퍼보다 안정적이지만 2mm 암 소켓을 부착하려면 수정이 필요합니다. |
| 자동 나노리터 인젝터 | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | 자동 나노리터 인젝터 |
| 콜라겐분해효소, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| 차동 전압 프로브 | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| 아날로그-디지털 신호 변환기 | 분자 장치, 미국 캘리포니아주 산호세 | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타 | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| 열선 절단기 | Amazon.com | Proxxon 37080 | 대안은 풋 컨트롤 페달이 있는 Hercules 8500 DHWT입니다. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| 마그네틱 홀더 베이스 | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, | USA MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| 난모 세포 클램프 증폭기 | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose, CA, USA | 버전 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | 사양: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (리보뉴클레아제 억제제) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| 분광 광도계 NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| 튜브 클램퍼 | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | 바로 사용할 수 있지만 작은 자기베이스로 인해 위치가 이동하기 쉽습니다. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, 브룩스빌, 플로리다, 미국 | IMP-XL-FM |
참고문헌
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A reso....
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