Mätning av syreförbrukningshastighet i akuta striatala skivor från vuxna möss
Summary
Syreförbrukningshastighet (OCR) är en vanlig proxy för mitokondriell funktion och kan användas för att studera olika sjukdomsmodeller. Vi utvecklade en ny metod med hjälp av en Seahorse XF-analysator för att direkt mäta OCR i akuta striatala skivor från vuxna möss som är mer fysiologiskt relevant än andra metoder.
Abstract
Mitokondrier spelar en viktig roll i cellulär ATP-produktion, reglering av reaktiva syrearter och Ca2+ koncentrationskontroll. Mitokondriell dysfunktion har varit inblandad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom och Alzheimers sjukdom. För att studera mitokondriernas roll i modeller av dessa sjukdomar kan vi mäta mitokondriell andning via syreförbrukningshastighet (OCR) som en proxy för mitokondriell funktion. OCR har redan framgångsrikt mätts i cellkulturer, såväl som isolerade mitokondrier. Dessa tekniker är dock mindre fysiologiskt relevanta än att mäta OCR i akuta hjärnskivor. För att övervinna denna begränsning utvecklade författarna en ny metod med hjälp av en Seahorse XF-analysator för att direkt mäta OCR i akuta striatala skivor från vuxna möss. Tekniken är optimerad med fokus på striatum, ett hjärnområde som är involverat i PD och Huntingtons sjukdom. Analysatorn utför en levande cellanalys med användning av en 24-brunnsplatta, vilket möjliggör samtidig kinetisk mätning av 24 prover. Metoden använder cirkulärstansade bitar av striatala hjärnskivor som prover. Vi demonstrerar effektiviteten av denna teknik genom att identifiera en lägre basal OCR i striatala skivor av en musmodell av PD. Denna metod kommer att vara av brett intresse för forskare som arbetar inom området PD och Huntingtons sjukdom.
Introduction
Mitokondriell dysfunktion har varit inblandad i flera neurologiska sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom och Alzheimers sjukdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) möss och råttor visar nedsatt mitokondriell funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isolerade från striatum (STR) eller hela hjärnan hos åldrad PINK1 KO-mus uppvisar defekter i komplex I 7,10,12,13. Direkt mätning av syreförbrukningshastigheten (OCR) är en av de vanligaste metoderna för att utvärdera mitokondriell funktion eftersom OCR är kopplat till ATP-produktion, mitokondriernas huvudsakliga funktion14. Därför kan mätning av OCR i sjukdomsmodeller eller patientbaserade prover/vävnad hjälpa till att undersöka hur mitokondriell dysfunktion leder till sjukdom.
För närvarande finns det flera sätt att mäta mitokondriell OCR, inklusive Clark-elektroden och andraO2-elektroder,O2 fluorescerande färgämne och den extracellulära flödesanalysatorn 15,16,17,18,19. Som en fördel tillåterO2 elektrodbaserade metoder att olika substrat enkelt kan tillsättas. De är emellertid otillräckliga för att samtidigt mäta flera prover. Jämfört med traditionellaO2-elektrodbaserade metoder erbjuder den extracellulära flödesanalysatorn, ett vanligt verktyg för OCR i cellkulturer eller renade mitokondrier, förbättrad genomströmning 15,18,20. Ändå används alla dessa metoder vanligtvis för att mäta OCR i isolerade mitokondrier eller cellkulturer 6,16,17,19,20,21. Isoleringen av mitokondrier orsakar oavsiktlig skada, och extraherade mitokondrier eller cellkulturer är mindre fysiologiskt relevanta än intakta hjärnskivor22. Även när mikroelektroder används i skivor är de mindre känsliga och svårare att använda än i odlade celler23.
För att möta dessa utmaningar utvecklade vi en metod med hjälp av XF24 extracellulär flödesanalysator, som möjliggör analys av flera metaboliska parametrar från akuta striatala hjärnskivor av möss24. Denna teknik ger kontinuerlig direkt kvantifiering av mitokondriell andning via OCR. I korthet placeras små delar av striatala hjärnskivor i brunnar på öplattan, och analysatorn använder syre- och protonfluorescerande baserade biosensorer för att mäta OCR respektive extracellulär försurningshastighet 17,21,25.
En av analysatorns unika egenskaper är de fyra injektionsbrunnarna, som möjliggör fortsatt mätning av OCR medan sekventiellt injicerar upp till fyra föreningar eller reagenser; detta möjliggör mätning av flera cellulära andningsparametrar, såsom basal mitokondriell OCR, ATP-länkad OCR och maximal mitokondriell OCR. De föreningar som injicerades under mätningarna för protokollet som visas här var arbetskoncentrationer av 10 mM pyruvat i den första lösningsbrunnen (port A), 20 μM oligomycin i den andra lösningsbrunnen (port B), 10 μM karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) i den tredje brunnen (port C) och 20 μM antimycin A i den fjärde brunnen (port D), baserat på Fried et al.25. Det måste noteras att dessa koncentrationer var arbetskoncentrationer och stamlösningar av 10x, 11x, 12x och 13x injicerades i lösningsportarna A till D. Syftet med att använda varje lösning var följande: 1) Pyruvat var nödvändigt eftersom utan det skulle tillsatsen av FCCP ha ett minskat OCR-svar orsakat av en begränsning av tillgängliga substrat; 2) Oligomycin hämmar ATP-syntas och möjliggör mätning av ATP-länkad andning; 3) FCCP frikopplar oxidation från fosforylering och möjliggör mätning av maximal mitokondriell kapacitet; 4) Antimycin A hämmar komplex III i elektrontransportkedjan och möjliggör därför mätning av OCR som inte är kopplad till mitokondrierna.
Koncentrationen av oligomycin som användes bestämdes baserat på följande skäl: 1) Den rekommenderade dosen oligomycin för de flesta celltyper (isolerade mitokondrier eller cellkulturer) är 1,5 μM. Av erfarenhet används vanligtvis 3x-10x av dissocierad celldos för skivexperimenten eftersom det kan finnas en gradient och penetreringen av lösningen i skivorna tar tid. Därför bör koncentrationen ligga i intervallet 5 μM till 25 μM. 2) En 20 μM koncentration valdes baserat på Fried et al.25. Högre koncentrationer prövades inte på grund av oligomycinets icke-specifika toxicitet. 3) I rapporten från Underwood et al.26 gjorde författarna ett titreringsexperiment för oligomycin och fann att doser vid 6,25, 12,5, 25 och 50 μg / ml resulterade i liknande hämning. Den högre koncentrationen av oligomycin (50 μg/ml) hämmade inte mer utan hade en större varians. 4) I vår observation verkar den avgörande faktorn vara oligomycinets penetrerande förmåga. Det är svårt för oligomycin att tränga in i vävnaden, och det är därför det tar minst 7 till 8 cykler för att nå platån, det maximala svaret. Så länge den når platån antas hämningen vara maximal.
En viktig teknisk utmaning med att anpassa den extracellulära flödesanalysatorn för mätning av OCR i striatala skivor är att förhindra vävnadshypoxi. Eftersom bufferten inte syresattes under hela mättiden (ca 4 h) var hypoxi en central fråga. Detta gäller särskilt för tjockare vävnadsprover, där syre inte kan diffundera genom proverna. För att övervinna detta problem delades skivor med en tjocklek på 150 μm, så att omgivande syre kunde tränga in i mitten av hjärnskivorna. Dessutom tillsattes 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) till den pre-oxygenerade artificiella cerebrospinalvätskan (ACSF), vilket underlättade bestämningen av maximal OCR, som tidigareföreslagits 23. Vi undersökte om cellerna levde. Först användes Hoechst 33258 (10 μM) och propidiumjodid (10 μM) för att undersöka om cellerna var friska under dessa förhållanden. Vi undersökte sedan om medelstora taggiga nervceller var funktionellt friska med hjälp av patch-clamp-inspelning. Vi utvärderade vidare om dopamin (DA) terminaler i striatalskivorna var funktionellt friska genom att mäta DA-frisättning med hjälp av snabbskannadvoltametri. Resultaten visade att striatala skivor som inte syresattes (ACSF/BSA-gruppen) var lika friska som den syresatta kontrollgruppen24.
Vi testade sedan olika kombinationer av skivtjocklek och stansstorlek för att bestämma optimala striatala skivförhållanden för flödesandningsanalysen. Dorsala striatala skivor med olika tjocklekar (150 μm och 200 μm) och stansstorlekar (1,0 mm, 1,5 mm och 2,0 mm i diameter) användes för OCR-analys med hjälp av analysatorn. Striatala skivor som var 150 μm tjocka med en stansstorlek på 1,5 mm i diameter hade den högsta kopplingseffektiviteten och OCR inom ett optimalt intervall för analysatorn24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden vi utvecklade gjorde det möjligt att använda en XF-analysator för att mäta OCR i striatala skivor från vuxna möss under en tidsperiod på 4 timmar. Denna metod ger ett nytt sätt att mäta cellulär bioenergetik i slag som skärs ut från anatomiskt definierade hjärnstrukturer. Eftersom vävnadsproverna som analyseras är ganska små kan de metaboliska parametrarna för specifika hjärnområden som är involverade i en sjukdom undersökas. Dessutom efterliknar användningen av akuta skivor närmare den fys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Wangchen Tsering och Pamela Walter för deras kritiska läsning och redigering av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 till CJ L. och NS098393 till H.Z.) och Institutionen för neurovetenskap vid Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
