Summary
该协议描述了使用标准荧光显微镜上氧化和细胞死亡的多参数分析来生成用于生物打印的高通量球体。这种方法可以应用于控制球体的活力并进行标准化,这对于3D组织建模,肿瘤微环境和成功的(微)组织生物制造非常重要。
Abstract
多细胞球体是在3D中研究组织和癌症生理学的重要工具,并且经常在组织工程中用作生物制造的组织组装单元。虽然球体模型的主要功能是在组织微观尺度上模拟物理化学梯度,但球体内部的真实生理环境(包括代谢活动,氧合,细胞死亡和增殖的动力学)通常被忽略。同时,生长培养基组成和形成方法对所得球体表型的影响得到了很好的记录。因此,需要对球状体表型进行表征和标准化,以确保研究结果的可重复性和透明度。分析平均球体氧合和三维(3D)中O2梯度的值可能是球体表型表征的一种简单而通用的方法,指出它们的代谢活性,整体活力和在体内组织微环境中概括的潜力。3D氧合的可视化可以很容易地与附加生理参数(如细胞死亡,增殖和细胞组成)的多参数分析相结合,并应用于连续氧合监测和/或终点测量。O2探针的加载是在球体形成阶段进行的,并且与球体生成的各种协议兼容。该协议包括一种高通量球体生成方法,引入红色和近红外发射比例荧光O2纳米传感器,以及生物打印前后球体氧合和细胞死亡的多参数评估的描述。实验实例显示了同种和异细胞球体以及基于球体的生物打印结构中的O2梯度比较分析。该协议与具有多个荧光滤光片和一个发光二极管作为光源的传统荧光显微镜兼容。
Introduction
分子氧(O2)是调节细胞和组织活力,功能和死亡的关键代谢物之一。在生理条件下,局部组织氧合受组织血管形成、血流和细胞代谢的动态调节,在某些情况下导致O2梯度、缺氧微环境和/或氧化应激1,2的形成。细胞通过分子O2在信号传导功能中的直接参与(通过缺氧诱导因子(HIF)介导的信号传导,组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM和其他方式)来感知O2梯度,细胞氧化还原电位的变化(通过Nrf2 / Keap1信号传导或铁调节蛋白感知反应O 2物种),并随后可以调节它们的代谢,增殖, 效力和分化3.因此,细胞和组织氧合的异质性,其梯度以及相关现象是组织发育和稳态的重要参与者。不同的组织和细胞类型通常需要不同的“正常”生理O2水平,这定义了特殊的组织结构,其中细胞根据组织O2微级4定位。一些细胞类型对 O2 降低敏感(例如,神经元、肝细胞、胰岛细胞或肌肉细胞)5,6,而其他细胞类型可以承受极端缺氧并形成陡峭的 O2 梯度(例如,在肠道和结肠上皮中)7。随着组织生物工程和生物制造的进步,O2定量在微团聚体和球体3D组织构建体中的必要性变得非常重要。其中一个问题是多细胞球体模型生理参数的标准化,这取决于球体生成方法和培养条件8。此外,在缺乏功能性血管形成的微组织中不受控制地施用O2释放生物材料或O 2灌注可能对细胞有毒,导致其代谢的重新编程,并降低移植后存活率9,10。O2测量方法的可信度和氧合环境的优化以达到生理相关微团聚体的高效培养最近被多能干细胞衍生的肝球体的数学建模作为示例11所证明。组织O2水平知识得到认可的另一个领域是癌症治疗12,13。异质性肿瘤缺氧会损害成功的抗癌治疗。在患者治疗或肿瘤缺氧建模期间测量和控制确切的氧合水平将允许改进个体和个性化治疗策略14。因此,定量监测生物制造构建体和3D肿瘤模型中的动态氧合是对其呼吸活性,代谢和组织培养优化,制造条件或缺氧介导的治疗反应进行基础研究的生理学分析的重要工具。
许多方法能够对球体和微聚集组织构建体中的细胞氧合进行多重(或多参数)分析。基于磷光寿命成像显微镜(PLIM)的方法以神经球和肿瘤球体15,16,17为首,能够直接定量活微组织中的细胞氧合,并建立其与细胞活力,增殖或功能细胞类型分布的相关性。尽管这种方法很强大,但即使在流行的显微镜供应商18,19中,PLIM显微镜升级仍未广泛使用。幸运的是,大量的细胞穿透O2敏感纳米颗粒探针也可用于基于荧光强度的比例测量模式15,17,20,21,22,23,24。通常,探针将显示两个发射波长,即O2敏感和不敏感(参考),可以在荧光显微镜,高内涵筛选成像仪或酶标仪上测量。这种O2感测纳米颗粒可以通过沉淀技术生产,具有生物相容性聚合物,O2感测和跨越可见光和近红外光谱的参比染料,或者它们可以在商业上购买2,25。由于使用红移荧光染料对厚3D微组织的分析将受益,因此构建了由O 2感应PtTPTBPF26和参考aza-BODIPY27染料组成的比例O2感测纳米粒子探针多模态红外1号(MMIR1)。采用这种设计,O2敏感信号(近红外,激发(exc.)= 635 nm,发射(em.)= 760 nm;I感)受[O2]浓度的影响通过磷光淬灭工艺,而红色参比染料强度(exc. = 580 nm, em. = 650 nm;Iref)不受影响(图1A)。因此,Iref/I在染色细胞中的感应比(R)可以使O22校准。
在这里,我们描述了一种半定量方法,用于监测球体和生物打印构建体中的活细胞氧合,有助于估计终点和动力学测量中的O2梯度。这种O2成像可以使用其他类型的比例O2探针(图1B)进行,并且根据可用光源和荧光滤光片的数量,可以与其他染料一起使用,以获取有关活/死细胞,线粒体功能以及示踪其他细胞类型的信息。高级测量模式如荧光寿命成像显微镜(FLIM)也可以使用19。使用细胞染色染料和O2敏感纳米颗粒的最大挑战是染色方案的优化。在MMIR1探针和相关纳米颗粒的情况下,细胞在球体形成过程中被预染色或共孵育。在所描述的方案中,在低贴壁琼脂糖表面29,30,31,32上生成O2探针染色的球体(图1C),这使得随后基于球体的生物打印和O2和细胞死亡的多参数分析成为可能。为了说明该方法的适用性,使用常规荧光显微镜比较了生物打印前后同种或异质细胞(由添加人脐静脉内皮细胞,HUVEC形成)人牙髓干细胞(hDPSC)球体中的氧合水平。
Protocol
1. 高通量生成球体,带内置 O2 敏感探头
- 一种微图案化琼脂糖包被组织培养板的制备方法
注意:微图案琼脂糖包被的组织培养板用于同时生成大量球体(每个PDMS图章1585个,见 材料表),用于生物打印和其他应用,其中需要多个实验重复或大球体编号。- 准备所有无菌材料和器械(刮刀和镊子),尽可能通过高压灭菌或过滤器灭菌。从琼脂糖中清洁可回收的PDMS印章33 ,并将其无菌储存在70%乙醇中。在球体生成前至少1天这样做。
- 将微图案的PDMS印章从储存小瓶转移到无菌培养皿中,并在无菌层流气流条件下用光滑的表面风干10分钟。
- 将每个带有微图案表面的印章向上(和光滑的表面向下)放在12孔无菌组织培养板孔的中间。用打开盖子风干1-2分钟。
注意:蒸发多余的液体非常重要,因为只有干印章才能完全粘附在塑料表面上,并在过程中保持附着。 - 称取1.5g琼脂糖到干净的200 mL玻璃瓶中,加入50 mL无菌蒸馏水,盖上盖子,在微波炉中融化,制成50 mL 3%均质琼脂糖溶液。
注意:琼脂糖溶液非常热,必须谨慎处理。如果在熔化过程后立即摇晃,热琼脂糖溶液可以开始冒泡并冲出容器。为避免偶尔的创伤,请使用足够大的血管,其中填充了琼脂糖溶液中最大50%的体积。 - 使用无菌血清学移液器立即向12孔细胞培养板的每个孔中加入约2 mL热琼脂糖溶液,以完全覆盖插入的PDMS印章。通过打开板盖在无菌气流下孵育,使琼脂糖凝固20分钟。
注意:琼脂糖层应至少比PDMS印章厚两倍,以确保去除PDMS印章后琼脂糖微孔的完整性(图1C)。 - 使用无菌小刮刀,在每个孔中将嵌入的PDMS印章准确地将琼脂糖倒置,以使印章表面光滑。在印章光滑的顶部加入约200μL无菌水,用刮刀将其从琼脂糖中轻轻分离,然后将其从孔中取出。避免损坏微孔。
- 将1 mL相应的无菌细胞培养基加入琼脂糖印章中直接使用。用盖子盖住板并在4°C下孵育过夜。 使用PBS溶液(而不是介质)长期储存(在4°C下长达2周)。不要让琼脂糖干燥。使用前,在CO2 培养箱中在37°C下加热琼脂糖微图案板1小时。
注意:需要孵育以平衡和去除琼脂糖微孔中的气泡。继续执行协议步骤 1.2。
- 准备 O2 探头加载的球体
- 分别使用补充10%胎牛血清(FBS)和生长因子补充内皮细胞生长培养基2的α-最小必需培养基(MEM)进行hDPSC和HUVEC细胞系的培养。通过以1:1的比例加入HUVEC和hDPSC生长培养基,制备hDPSC / HUVEC异细胞球体生长培养基。
- 准备70%-90%融合细胞培养物(制备约3-4天)。为了产生异细胞球体,分别制备hDPSC和HUVEC培养物。
注意:HUVEC和hDPSC的通道数不得超过8。为了确保细胞培养物的快速生长,始终以总细胞培养物的1/3(70%-80%汇合度)每3至4天使用一个新的烧瓶分裂。 - 用预热(37°C)PBS(每75cm2 烧瓶10mL)冲洗70%-90%融合细胞培养物。加入解离酶溶液(0.05%胰蛋白酶和1mM EDTA;每75cm2 烧瓶1mL),并在37°C下在5%CO2,95%湿度下孵育3-5分钟,用于细胞分离并在显微镜下检查细胞分离。完成后,用含有10%FBS的完整细胞培养基中和胰蛋白酶(每1 mL解离溶液中和5mL培养基)。
注意:防止细胞过度暴露于解离酶溶液中,因为这会影响它们的活力。 - 对于在低FBS培养基中培养的HUVEC,通过在胰蛋白酶处理的细胞培养物中加入0.5mL的100%FBS来进行胰蛋白酶中和,然后离心以将细胞转移到其生长培养基中。
注意:获得的细胞悬浮液每1毫升应含有约100万个细胞。如果需要,可以在方案中添加额外的离心步骤以浓缩细胞悬浮液。 - 通过在10 mL血清学移液器顶部使用1000μL移液器吸头移液来获得单细胞悬浮液,从而解离细胞聚集体。使用计数室(Neubauer型血细胞计数器或替代品)来计数每1mL细胞悬浮液34的细胞数。将细胞悬浮液稀释至每毫升500,000个细胞。对于1:1球体比例的异细胞hDPSC / HUVEC,加入等体积的相应细胞悬浮液,最终细胞浓度为每mL500,000个细胞。
注意:添加到微图案琼脂糖印章的悬浮液中细胞浓度的变化允许改变所生产球体的平均尺寸,这取决于琼脂糖印章的每个微孔的细胞数。在所描述的设置中,从含有500,000个细胞的1mL在具有1585微孔的琼脂糖印章上产生〜300个细胞的球体。 - 将浓缩的O2 探针(纳米颗粒,1mg / mL储备液)溶液加入制备的细胞悬浮液中,最终浓度为5μg/ mL。
注意:在O2感应纳米颗粒存在下形成球体可提供有效的染色,其保存至少5天(图1D)。相比之下,用纳米颗粒对预成型的多细胞球体进行染色效率会降低15. - 在12孔琼脂糖包被的细胞培养板(见步骤1.1.7)的微图案化孔中交换1mL旧培养基,以获得1mL制备的细胞悬浮液(每1mL500,000个细胞,用5μg/ mL O2 探针)。在O 2探针的连续存在下,在CO2 培养箱中培养球 体2-5天,以确保其在球体形成和压实过程中的负载。
注意:避免在球体培养物中过多的培养基蒸发。如果需要,小心(不要干扰微孔中的球体)加入0.2-0.5mL培养基,并加入额外的O2 探针稀释液。 - 在球体形成后,用没有探针的新鲜培养基交换生长培养基。探针染色将在生成的球体中保存7-14天或更长时间,从而可以长期监测其在球体中的信号。
2. 球体生物打印
注意:球体在甲基丙烯酰胺改性明胶(GelMA)基生物墨水中生物打印。以下是生物墨水成分,生物墨水制备程序和生物打印的描述。
- 生物墨水制备
- 在层流气流35 下在培养基中制备10%(w / v)GelMA溶液(2 mL),如下所示:在15 mL管中称出0.2g无菌GelMA,取代度为78,加入1.9mL α-MEM,并通过在37°C(〜2小时)的旋转振荡器上混合使其溶解。
注意:不要添加足量的培养基,因为稍后将添加其他化合物,例如球体和光引发剂Li-TPO-L。 - 通过移液将球体重悬于微图案孔中,并将其收集在15mL管中。用PBS进行额外的冲洗,以确保从琼脂糖微孔中收集所有球状体。避免触摸/损坏琼脂糖微孔,因为琼脂糖薄片会在生物打印过程中阻塞针头。
- 通过在15mL管中以300× g 在20°C下离心5分钟来收集球体。 用移液管吸出上清液,向球状体中加入50μL培养基,并通过轻柔移液重悬它们。
- 将球体混合物加入温热的GelMA溶液中,并通过温和移液混合。将球体浓度维持在每mL生物墨水6340-12860个球体(从4-8微图案)进行生物打印。避免使用较高浓度的球体,因为它容易导致印刷针堵塞。
- 加入过滤灭菌的光引发剂Li-TPO-L储备溶液(32mg / mL),终浓度为2 mol%,相对于双键数,并通过轻柔移液36,37混合。
注:Li-TPO-L的用量可根据下式计算:
光引发剂(PI)的体积=(0.000385摩尔NH2-基团/克GelMA×294.10克Li-TPO-L/摩尔×0.78×0.02)/0.032克Li-TPO-L/mL×0.2克GelMA=0.0107毫升Li-TPO-L储备液
- 在层流气流35 下在培养基中制备10%(w / v)GelMA溶液(2 mL),如下所示:在15 mL管中称出0.2g无菌GelMA,取代度为78,加入1.9mL α-MEM,并通过在37°C(〜2小时)的旋转振荡器上混合使其溶解。
- 生物打印程序
- 请参阅 补充协议 1 中的步骤,了解 CAD 中的脚手架设计。要生物打印设计,请按照以下步骤操作。
- 用吸头盖(鲁尔锁)关闭无菌3 cc墨盒的末端,并通过移液填充生物墨水。将柱塞插入墨盒。将墨盒倒置并取下吸头盖,将柱塞推向生物墨水,直到滤芯中的所有空气都被清除。
注意:避免GelMA生物墨水与滤芯侧面之间的接触,因为这可能会由于生物墨水的凝胶化而抑制柱塞的移动。 - 让生物墨水在23°C(20-30分钟)下在生物打印机的加热地幔中冷却。拧入墨盒顶部的压力适配器。关闭进管上的夹子以防止生物墨水泄漏,在墨盒上安装一个22 G锥形PE针。使针的尺寸和直径适应支架设计以及球体直径和浓度。
注意:戴口罩和喷洒手套以防止污染。 - 用70%乙醇喷洒生物打印机,并用吸收纸擦干。将墨盒安装在基于挤出的打印头上的加热地幔中。堵塞压力入口并打开入口上的夹子。将设计的 G 代码文件加载到打印软件中。
- 开始测量针的长度。通过在无菌培养皿中分配一点生物墨水来调节印刷压力。0.025-0.045 MPa的印刷压力是典型的基于GelMA的生物墨水38。
- 安装6孔板,打开孔板,关闭罩,然后开始打印。打印后,让支架在5°C下物理交联10分钟,并用UV LED灯(365nm; 500 mW,制造商)照射打印的支架60秒。
注意:紫外交联时间取决于紫外光的性质、光引发剂类型和浓度、所需的支架交联程度、溶胀和弹性模量。 - 立即将含有100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素(P / S)的相应生长培养基加入具有生物打印网格的所有孔中(6孔细胞培养板的每孔2mL)。
- 在37°C CO2 培养箱中培养,直到开始显微镜检查。对于生物打印结构显微镜,将打印的华夫饼网格转移到显微镜皿中,用成像介质覆盖,然后继续步骤3.2和3.3。
注意:在浮动生物打印结构的情况下,它们必须固定在显微镜培养皿中而不会影响细胞活力,例如,使用细胞相容性胶水。对于倒置显微镜转移,将生物打印到显微镜玻璃底培养皿中并用成像介质(〜200-500μL,参见步骤3.1的注释用于成像介质组成)覆盖,以避免不希望的样品漂浮。在将生物打印的构建体转移到显微镜培养皿之前,可以在细胞培养皿中用额外的荧光探针进行染色(参见步骤3.1.6)。
3. 生物制造组织中球体氧合的比例荧光实时显微镜
注意:为了将O2 探针的比例强度响应(R)转换为实际缺氧水平,必须使用24中描述的程序校准探针响应。然而,由于比率校准是特定于仪器的,并且需要安装 T/O2/CO2 控制的培养箱(并非始终可用),因此使用半定量比率检测是首选。
- 用于实时成像分析的球体制备
- 对于此步骤中的球体附着,用胶原IV和/或聚-D-赖氨酸预涂覆无菌显微镜培养皿或使用市售的39。检查显微镜培养皿与显微镜工作距离和物镜其他特性的兼容性。
注意:在多参数成像的情况下,所有额外的染色程序都必须在培养板培养皿中完成,并具有足够量的培养基,以保护细胞免受蒸发,渗透冲击或其他应力。使用前准备和预热成像培养基:DMEM补充碳酸氢钠(1.2g / L),HEPES-Na,pH 7.2(10mM),丙酮酸钠(1mM),L-谷氨酰胺(2mM)和葡萄糖(5mM),不含酚红。 - 使用1 mL移液器,轻轻地从琼脂糖微孔中洗出O2探针预染色的球体。当球体仍然漂浮在介质中时,将它们转移到15 mL锥形底管中。
- 为了确保从微图案孔中收集所有球体,用额外的1mL培养基冲洗孔1至3次,将所有球体悬浮液组合在一个小瓶中。将小瓶置于垂直位置长达10分钟,让球体沉降在小瓶底部,形成可见的颗粒。
- 小心地从管中取出介质,使球体不受干扰。轻轻地将它们重悬于新鲜培养基的量中,该量将足以用于每个显微镜样品皿中至少20个球体。这将最大限度地减少培养基的使用,并简化成像过程中球体的定位。
注意:使用附着在盖玻片上的μ室12孔板(参见 材料表)的可高压灭菌硅部分作为显微镜样品皿(24 x 60 mm,厚度#1),每孔最大培养基体积为300μL。当粘附在培养皿上时,该培养室的硅部分可以灭菌并与任何其他塑料和玻璃表面一起重复使用。 - 立即向每个显微镜培养皿/孔中加入等体积的球状悬浮液。将球体在37°C下在CO2 培养箱中放置1小时以附着在显微镜皿的表面上。对于氧合分析以及使用其他染料,请继续执行步骤3.1.6。对于简单的氧合分析,请继续执行步骤3.1.7。
注意:孵育时间不足(<1小时)会导致培养基交换过程中偶尔去除球体和丢失,从而中止实验。同时,由于细胞从球体迁移到显微镜皿表面并影响其实时氧合作用,过度孵育(>3小时)可导致其3D组织的部分或完全丧失。 - (可选)小心地将培养基与稀释至染色浓度的含有荧光探针的培养基交换,并继续孵育1小时以达到最佳强度。为避免在培养基交换过程中去除球体,请用200μL移液管小心地从显微镜培养皿的边缘吸出培养基,并在显微镜皿中横向添加培养基。继续执行步骤 3.1.7。
注意:为了使用在多细胞聚集体中扩散不良的探针进行高效染色,请延长负载浓度和/或时间。使用前,在初步实验中确定可选的探头负载参数。 - 从显微镜培养皿中取出培养基,并用成像培养基冲洗一次。向样品中加入精确量的成像培养基(例如,12孔培养板的每个微孔μ室300μL)。继续执行步骤 3.2。
- 对于此步骤中的球体附着,用胶原IV和/或聚-D-赖氨酸预涂覆无菌显微镜培养皿或使用市售的39。检查显微镜培养皿与显微镜工作距离和物镜其他特性的兼容性。
- 图像采集
- 在成像前30分钟打开显微镜和连接的设备(即激发光源,相机,计算机,培养箱和其他操作电子块)以预热并平衡到测量条件(温度,O2的不同值,5%CO2,湿度如果需要)。启动与精确显微镜设置一起提供的显微镜操作软件。
注:所述方案适用于CellSens Dimension软件v.3。 - 为所选荧光(或磷光)探针选择合适的激发(光源、功率)和发射滤光片以及曝光时间。对于多参数、3D和延时显微镜分析,请在操作显微镜软件中编写自动测量序列协议。
- 在初步实验中,根据经验确定每个探针、实验模型和细胞系的最佳成像设置。确保设置在参考(Iref)和O2 传感(Isens)通道中具有最小的光漂白,并且对强度比(R = Iref / Isens)的影响最小,特别是在3D和延时测量实验中。
- 在显微镜载物台上设置带有染色球体的显微镜皿。使用低倍率物镜,在透射光下预览样品,对球体进行初步聚焦并将其定位在图像中心。
注意:标准的4倍至10倍放大倍率的空气物镜足以进行预聚焦,而对于实际测量,我们建议使用20倍至40倍的数值孔径(NA)或更高的(空气或水浸)物镜,其工作距离足以用于连接到培养皿上的球体。 - 将具有所需高放大倍率的物镜带到工作位置。专注于球体中间(赤道)横截面的透射光模式。3D物体中的氧合作用直接取决于成像部分的深度。为确保这一点,分析组内和组之间的相似横截面,例如,球体的中间和顶部/底部横截面。
注意:为了详细和精确地分析和重建O2 梯度,我们建议使用共聚焦,光片或双光子(最佳选择)显微镜扫描和生成Z轴堆栈。对于传统的宽视场显微镜,其中将同时收集来自所有横截面的信号,可以按中间横截面进行平均估计,而不是对O2 梯度进行精确分析。在这种情况下,中间横截面被定义为焦点截面,其中球体具有最大直径,并且其边界上具有尖锐的焦点。 - 调整O2 探针和用于多参数成像的其他荧光探针的参考和灵敏光谱通道的荧光/磷光信号的收集设置。
- 对于基于定量强度的比较,对所有测量对象的曝光时间、激发光源功率、分辨率、扫描速度和针孔尺寸应用相同的成像设置。
注:许多供应商提供的显微镜软件版本都支持自动计算强度比。将功能合并应用于O2 探针的参考通道和敏感通道的强度测量,此时可在此处使用的成像软件中在实验管理器中编写成像采集程序。 - 从同一光学部分收集图像,用于O2 探针的参考和灵敏光谱通道,如果需要,还可以收集其他荧光通道。对于此方案,使用具有红色参考(exc. = 580 nm,em. = 650 nm)和近红外O2敏感(exc. = 635 nm,em. = 760 nm)光谱的MMIR1探针。
- 重复步骤 3.2.5-3.2.8 以收集足够数量的数据点进行统计分析。对于使用不同药物,线粒体解耦剂或电子传递链抑制剂和其他快速作用化合物治疗时快速进化的细胞反应的动态分析,请使用延时测量模式(步骤3.2.10)。
- 在37°C的成像介质中进行测量,并定期照明样品并收集目标荧光团的信号(例如,O2 探针参考和传感通道),例如,每10秒超过2分钟。
- 完成定期测量后,对每个球体执行焦点检查,以确保成像过程中没有焦点漂移。如果需要,可重复上述步骤。继续执行步骤 3.3 进行数据分析。
注意:在没有细胞刺激和药物添加的情况下,可以进行延时测量以评估光稳定性,与参比染料(例如荧光素,钙黄绿AM或四甲基罗丹明甲酯)相比。
- 在成像前30分钟打开显微镜和连接的设备(即激发光源,相机,计算机,培养箱和其他操作电子块)以预热并平衡到测量条件(温度,O2的不同值,5%CO2,湿度如果需要)。启动与精确显微镜设置一起提供的显微镜操作软件。
- 图像呈现
注:这里我们介绍如何自动计算O2 利用成像软件中的比率分析功能,在球体中探针强度比(R)并应用逐个像素的R计算,生成球体显微镜切片的假彩色R分布图像。R还可以根据参考的强度数据和从球体图像的同一感兴趣区域(ROI)收集的灵敏光谱通道的强度数据手动计算,方法是应用简单公式R = I裁判/I感应24,34.如果无法在相应的显微镜软件中从原始图像中提取强度数据,则可以使用ImageJ或Fiji等程序获得强度数据(参见讨论)。- 打开 .vsi 文件,其中包含在合并模式下创建的参考通道和敏感光谱通道中的 O2 探头强度数据。从测量菜单打开比率分析功能窗口。选择参考通道的强度作为分子,选择敏感通道的强度作为R计算的分母。
注意:用于计算R的参考信号和敏感信号的反向比率也是可能的,但在这种情况下,R将随着O2的增加而降低。 - 将相应的强度阈值设置应用于每个光谱通道,以从合并的强度图像中减去背景。继续增加阈值,直到图像背景均匀变黑。将阈值参数平等地应用于比较分析中使用的数据集中的所有旋转椭球体图像。
注意:使用预览窗口通过观察球体的初步计算假彩色 R 图像来优化阈值设置。强度低于阈值字段中当前值的所有像素将从 R 分析中删除并显示为黑点。在阈值应用之后,只应可视化与球体荧光相对应的区域。对独立光谱通道的平均背景强度(没有球体的区域)的初步估计简化了图像的适当阈值的选择。此外,应用从相应的透射光球体球体图像识别到合并荧光图像的旋转椭球体ROI边界有助于准确确定阈值参数,以防止过度减去非背景信号强度。 - 将分子和分母强度的背景设置保持在 0,因为背景已经使用阈值应用进行了减去。
- 调整比例因子(缩放)到比例图像,直到预览图像提供所需的 R 渐变分辨率。将缩放参数平等地应用于比较分析中使用的数据集中的所有旋转椭球体图像。
注意:缩放参数应足够大(至少 1,000),以确保 R 图像包含尽可能多的信息,并且可以被视为 R 数值数据的分辨率因子。 - 通过 按应用将调整后的参数应用于旋转椭球体图像。在工具窗口菜单的调整显示窗口中调整图像的亮度和对比度。
- 通过使用“调整显示”窗口中的固定缩放选项,手动确定比率分布直方图的链接和取消链接限制。这将确定 R 参数表示的假色条的范围。
注意:要比较不同组之间的球体图像,重要的是为所有分析样品保持相似的色条范围。由于组间 R 参数的变化范围可能不同,因此所选的假色条范围对于所有分析组中的分布直方图应是通用的。 - 球体通常不是理想的球形,假设球体直径是通过球体的中心(通常是缺氧核心)绘制的最长线。使用测量菜单中的线性标尺函数,确定球体直径。将数据导出为电子表格表文件。
- 选择所需尺寸(尽可能小)和形状(例如圆形)的ROI,并将其应用于球体的外围和缺氧核心。将 ROI 转换为测量对象,以分析所选 ROI 内的平均 R(外周 R-Rp 和核心 R-Rc)。以电子表格兼容的表格格式导出数据。
注意:球体在组间不具有相同的O2 分布,并且缺氧核心不与球体中心完全共定位。为了简化和标准化分析,我们假设最缺氧的区域对应于球体中心的理想核心。在这些区域中测量的Rc 用于计算O2 梯度范围(Rp-R c)和陡度(Rp-R c)/r,其中 r (理想情况下,外围和缺氧核心ROI之间的距离)是根据直径测量值计算的球体的近似半径,以μm为单位。或者,球体O2 梯度可以表示为沿球体直径进行的R参数改变的线性线轮廓(测量菜单中的线轮廓窗口)。此数据也可以导出为电子表格表文件。 - 将测量值应用于球体的每个显微镜部分,以获得球体直径的数据集,Rc 和Rp 以执行进一步的计算和统计比较。将所有数据合并到一个电子表格文件中。
- 对于光漂白或对不同刺激的动态响应的延时分析,请将所选ROI应用于集合中每个图像上的相同坐标。要比较R参数,请将它们显示为延时图像集中第一个周期R的百分比。
- 对于光漂白分析,使用来自多个投资回报率的R来计算每个延时周期的平均R百分比并跟踪变化。
- 假设在连续照明12个循环后初始强度降低不到5%,则光漂白效果并不重要。始终将动态变化与光漂白曲线作为对照进行比较,以确保比例延时响应的重要性(参见 图2A,B)。
- 从获得的参数计算数据集中单个球体的r,(R p-R c)和(Rp-R c)/r。通过柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫或相关检验分析数据分布的正态性。选择适当的统计方法进行数据分析,并继续数据表示数字。
注意:这里提供的数据是正态分布的,并且在p = 0.05处实施了独立的 t检验,用于球体组之间的统计比较。
- 打开 .vsi 文件,其中包含在合并模式下创建的参考通道和敏感光谱通道中的 O2 探头强度数据。从测量菜单打开比率分析功能窗口。选择参考通道的强度作为分子,选择敏感通道的强度作为R计算的分母。
Representative Results
图1C示意性地说明了使用微图案琼脂糖法生产O2探针预染色球体的高通量,显示了没有和具有预染色球体的琼脂糖微孔的示例。琼脂糖涂层上球体形成的效率及其形状/球形度可能是细胞特异性的。例如,与脂质包被的表面17相比,人结肠HCT116细胞从未使用琼脂糖微孔法形成理想的球形结构,而hDPSC单独并与HUVEC共培养总是产生高度可重复的形状和大小的球体,其形状和大小与细胞组成,初始细胞数和球体形成/生长的持续时间成正比。所有测试的细胞类型在球体形成期间有效地积累了O2探针纳米颗粒(图1B),并将这种染色保存至少5天,允许它们用于生物打印和随后监测生物打印组织氧合(图1D)。
图1:O2探针功能原理及其在球体染色和生物打印中的应用。 (A)简化的Yablonski图,解释了磷光纳米颗粒(NP)探针O2传感的原理。在禁止的三重态激发态(T)期间,能量向分子O2的转移导致磷光强度的降低与磷光寿命tau,τ成反比(从0%O2的τ1到21% O 2处的τ2的变化),这是激发到单线态(S1)和其返回到基态(G0)42之间的时间。定量O2测量可以通过比例测量或测量τ(磷光寿命测量)来完成。(B)用不同类型的纳米颗粒O2探针染色的人牙髓干细胞(hDPSC)球体染色的一个例子,显示在透射光,参考和O2敏感染料荧光通道中。比例尺为100μm.(C)使用微图案琼脂糖法生成高通量O2探针预染色球体的示意图。从左到右:PDMS硅印章放置在培养板的孔中,琼脂糖中的微孔图案示例(4倍放大率),以及HCT116人结肠癌细胞在接种微图案琼脂糖(4倍放大)后第2天由HCT116人结肠癌细胞产生的MMIR1预染色球体的示例。比例尺为100μm.(D)从左到右:生物打印的华夫饼结构和生物打印后第1天和第5天的MMIR1预染色球体生物打印结构的显微镜分析。荧光信号对应于MMIR1纳米颗粒中的O 2敏感磷光染料(例如= 635 nm / em. = 760 nm)。比例尺为400 μm。请点击此处查看此图的大图。
在所描述的显微镜设置(配备发光二极管(LED)作为光源的传统宽视场荧光显微镜)上,发现红色/近红外MMIR1探针在其参考和敏感染料的光稳定性方面是最好的,其初始强度比的亮度降低不到5%(R = Iref / Isens)。)经过12个周期的连续照明。这允许使用MMIR1探针动态实时研究hDPSC球体在用线粒体解耦合器(FCCP)和电子传递链复合物I抑制剂(鱼藤酮)处理时的快速呼吸反应(图2A,B)。我们发现,在干细胞衍生的球状体中,FCCP仅显示出温和的解偶作用,并且在添加该药物后约80秒内细胞呼吸略有下降,与先前报道的DPSC40的代谢特征一致。另一方面,鱼藤酮强烈抑制呼吸导致球体再氧合(反映为Rp -球体外围比值和Rc -球体核心比值的增加)和刺激后约80s内外围至核心O2 梯度的耗散(图2A)。MMIR1探针比值(R)在高(大气)和低(成像介质中存在亚硫酸钠和葡萄糖氧化酶的情况下)O2 水平的两点半校准证实了R的降低,这与通过抗霉素A /鱼藤酮鸡尾酒处理初步抑制呼吸的球体氧合减少有关(图2C),说明如何将MMIR1探针R的测量应用于3D中长期稳态和快速氧合响应的半定量监测。
图2:O2 探针对不同刺激响应的动力学分析。 (A)hDPSC球状体氧合成像在休息时以及FCCP和鱼藤酮治疗反应的代表性结果。(B)MMIR1强度与FCCP和鱼藤酮处理的动力学响应比与初始光漂白强度比(%)相比。(C)HDPSC球体在含氧(抗霉素A+鱼藤酮加成)和脱氧(葡萄糖氧化酶加成)状态下MMR1探针的强度比图像的变化。该色条表示O2 探头强度比(R = Iref / Isens)在整个图像中的分布。 请点击此处查看此图的大图。
为了说明MMIR1探针在活体代谢成像中的应用,进行了同细胞hDPSC与异细胞hDPSC / HUVEC(1:1)球体中O2梯度的比较分析。利用自由的蓝色和绿色荧光光谱通道的可用性,与Hoechst 34580(HXT)和SYTOX Green(SYTOX)共染色,以演示O2探针在多参数研究中的应用(图3)。使用成像软件提供的逐像素强度比计算的自动协议,产生了球体中R分布的假彩色比图像,可视化了所有类型的球体中实时检测到的外围到核心O2梯度:中心是含氧外围和缺氧壁龛(图2和图3A)。然而,Rp和Rc值以及中间横截面中O2梯度的陡度因不同的球体类型而异:参见hDPSC与hDPSC / HUVEC球体中中间截面的线轮廓,以及hDPSC与生物打印的hDPSC球体(图3B,C)。由于没有被广泛接受的描述O2梯度的方法,我们引入了几个参数,以便于比较和详细描述一般球体氧合:Rp和Rc,以及O2梯度的特征,如含氧区和缺氧区之间的差异(Rp-R c),以及每μm氧合的平均变化(Rp-R c)/ r, 其中r是外围和缺氧核心之间的距离,在中间横截面与球体半径相关(图3D)。这些参数的统计比较以及SYTOX在球体中可视化的坏死细胞的数据,有助于我们得出球体细胞类型特异性O2分布梯度起源的初步结论。
图3:球体中氧合梯度的比较分析。 (A)印刷前后同细胞hDPSC球体和异细胞hDPSC / HUVEC(1:1)球体中氧合(MMIR1的比例荧光显微镜)和活/死细胞染色(Hoechst 34580,HXT,蓝色和SYTOX Green,SYTOX)的活显微镜检查的代表性例子。所有类型的球体中的hDPSC都来自相同的细胞培养物。在形成过程中用5μg/ mL的MMIR1探针预染色球体2天,然后用于成像或生物打印(仅限hDPSC球体),随后在生物打印后第1天进行成像分析。MMIR1染色球体的强度比(Iref / I感)图像的假彩色图像对应于其外围至核心O2 梯度。比例尺为100 μm。颜色条表示图像中 O2 探头强度比(R = Iref/I感应)分布。直径横截面的数字1和2对应于B和C中显示的强度曲线(B,C)均匀的hDPSC与异质hDPSC / HUVEC球体(B)和生物打印前后的均匀hDPSC球体(C)之间的强度比曲线的比较。测量(A)上所示的球体横截面的轮廓。(D)用于描述球体中外围至核心O2梯度的参数示意图,其中 r 为球体半径,Rp 和Rc 分别是球体外围和核心区域的强度比。颜色条示意性地表示 O2 梯度在理想情况下球形球体中从高(红色)到低(蓝色)水平的分布。(英、华)生物打印(F)之前和之后的第1天,hDPSC / HUVEC和hDPSC球体(E)和hDPSC球体中外围至核心O2梯度(Rp-R c)/ r 值的比较分析。对一次实验重复(n = 18-23)进行统计分析。框对应于标准差。星号表示组之间的统计差异(在p = 0.05时);** = p < 0.0005。 请点击此处查看此图的大图。
与同细胞hDPSC球体相比,hDPSC / HUVEC球体具有明显更陡峭的梯度:更高的(Rp-R c)/ r 参数和范围值(Rp-R c; 图 3F)。同时,它们显示出较高的外围(Rp)和核心(Rc)的氧合(图4A, 表1)。有趣的是,它们在统计学上也更大(图4A, 表1),这表明氧合的这种差异是由它们不同的细胞生物能量谱引起的。这些数据与HUVEC细胞的已知代谢特征一致,该细胞的呼吸活性通常较低,并且强烈依赖糖酵解和戊糖 - 磷酸途径作为ATP和NAD(P)H41的主要生物能量来源。同时,在异质球体中形成的明显的外围到核心O2 梯度很可能是由hDPSC在其组成中产生的,其特征在于超极化线粒体和活性电子传递链40 ,并且根据hDPSC球体氧化的结果,具有很强的呼吸活性(图3, 图4A和 表1).因此,通常hDPSC / HUVEC球体的较高活力通过用SYTOX染色的死细胞强度较低来证实(图3A)可能与其较高的氧合水平有关。
为了说明球体氧合的现场显微镜成像在生物制造中的适用性,MMIR1 O2探针预染色球体用于GelMA生物墨水的生物打印,并在生物打印前和生物打印后第1天比较hDPSC球体中的O2梯度(图3A,C,F,图4B和表2)。与生物打印前测量的球体相比,生物打印的hDPSC球体具有显着的氧化外围(更高的Rp),而其核心氧合具有相似的值(图4B)。其外围氧合的变化会影响其外围至核心O2梯度的范围((Rp-R c)和陡度的增加(增加(Rp-R c)/ r),这与生物打印前测量的hDPSC球体在统计学上不同(图3F和图4B)。生物打印的球体中的死细胞染色通常更亮,这表明球体活力的降低与球体氧合的改变有关(图3A)。
图4:MMIR1染色球体直径和强度比的比较分析。 (A)异质hDPSC / HUVEC与同细胞hDPSC球体的比较。(B)生物打印前后同种细胞hDPSC球体的比较。Rp 和Rc - 在球体的外围和核心的强度比;(Rp-R c) - 强度比的差异,对应于球体中O2 梯度的范围。对一个实验重复(n = 18-23)进行统计分析。框对应于标准差。星号表示组之间的统计差异(在 p = 0.05 时),其中 * = p < 0.005,** = p < 0.0005。 请点击此处查看此图的大图。
球体类型 (N) | 直径 [μm] | Rp [a.u.] | Rc [a.u.] | Rp-R c [a.u.] | (Rp-R c)/r [a.u./μm] |
HDPSC / HUVEC (18) | 113.2 ± 10.6 | 0.779 ± 0.034 | 0.398 ± 0.055 | 0.982 ± 0.051 | 0.00677 ± 0.00091 |
hDPSC (18) | 88.1 ± 9.9 | 0.558 ± 0.025 | 0.331 ± 0.034 | 0.227 ± 0.032 | 0.00520 ± 0.00090 |
p 值 | 1.5 x 10-8 * | 1.5 x 10-21 * | 1.3 x 10-4 * | 1.4 x 10-12 * | 9.2 x 10-6 * |
表 1. 球体直径,球体核心(Rc)和外围(Rp)处的强度比,异质hDPSC / HUVEC和均相hDPSC球体中强度比(R p-R c)和(Rp-R c)/r值的差异。N 个椭球体上 t 检验的 p 值显示统计差异,并用星号表示。
球体类型 (N) | 直径 [μm] | Rp [a.u.] | Rc [a.u.] | Rp-R c [a.u.] | (Rp-R c)/r [a.u./μm] |
hDPSC (18) | 88.1 ± 9.9 | 0.558 ± 0.025 | 0.331 ± 0.034 | 0.227 ± 0.032 | 0.00520 ± 0.00090 |
生物打印 hDPSC (23) | 80.9 ± 12.5 | 0.584 ± 0.023 | 0.323 ± 0.038 | 0.261 ± 0.039 | 0.00658 ± 0.00144 |
p 值 | 0.054 | 0.0024 * | 0.46 | 9.9 x 10-4 * | 6.3 x 10-6 * |
表 2. 球体直径,球体核心(Rc)和外围(Rp)的强度比,生物打印前后均匀hDPSC球体的强度比(Rp-R c)和(Rp-R c)/r值的差异。统计分析的 p 值(N 个球体)。统计差异用星号表示。
Discussion
意义。 组织氧合测量可以深入了解细胞和组织特异性代谢,组织生长和发育,活力,肿瘤发生和细胞迁移以及与微生物和其他病原体的相互作用。所提出的方法为更好地理解多细胞球状体培养物的生理学提供了一种新工具:使用比例纳米颗粒O2 探针分析氧合,并提供评估缺氧的方法,可视化对特定能量产生途径的依赖,并补充建模研究和替代代谢成像方法43,44 在广泛可用的低成本荧光显微镜上。比例测量可以在荧光宽视场(首选脉冲LED激发),激光扫描共聚焦,光片和双光子显微镜上进行,理想情况下配备了T和O2 培养箱。重要的是,所提出的O2 显微镜测量可以很容易地与各种生理参数和细胞示踪剂(在异细胞球状体培养的情况下),活力(活/死染色),脂质代谢(脂质传感荧光探针),pH动力学(染料,纳米颗粒和荧光蛋白)或[Ca2 +的实时多参数分析相结合],在可用的荧光光谱通道中或并行进行,从而扩展了球状体,生物打印构建体和潜在组织移植中的实时细胞功能。
球状体培养物在癌细胞,肿瘤和干细胞生态位微环境,类肿瘤,药物效率和毒性筛选的研究中被发现,并且实际上用作组织生物制造和自组装的组织构建块45。它们可以通过各种不同的方法从多种细胞类型46中生成。球体模型的普及需要从研究完整性和改进数据分析的角度进行标准化,最近通过开发第一个球体数据库8来尝试。
我们的方案有望帮助更好地了解活球体代谢,标准化该实验模型,并随后提高它们在生物打印和植入材料中的长期稳定性,再现性和可行性。
修改。该协议描述了使用微图案化的琼脂糖低粘附表面(基于微晶的形成29)用于氧合分析的高产率生成O2 探针负载球体。球体生产的替代方法,如悬挂液滴,超低附着板的应用,脂质涂层或自由浮动形成也与建议的O2 探头加载协议兼容。所提出的方案针对hDPSC球体和hDPSC与HUVEC的共培养球体进行了优化(1:1)。其他细胞系当然适用15,17,47,48;然而,由于不同的细胞粘附特性,培养条件,代谢底物要求以及细胞与纳米颗粒染色的相容性,可能需要一些方案优化。选择合适的比例纳米颗粒O2敏感探针必须取决于特定的细胞模型,并根据所用显微镜设置下的探针光漂白特性(光源的强度和类型,相机的光谱灵敏度)以及相应的参考和探针的O2敏感光谱通道的适当激发/发射滤光片的可用性。
一些比例式O2 探头是市售的2。或者,它们可以通过参比染料和O2敏感染料与聚合物在内部共沉淀来制备,如其他地方24,25,49所述。对于每个单独的模型,应进行初步测试,以确定适当的探针和最佳显微镜条件,并在比例测量期间最大限度地减少探针光漂白或光诱导O2 消耗的影响。先前对O2传感纳米颗粒的研究表明其细胞毒性低,允许在广泛的染色浓度(1-20μg/ mL)中应用。由于一些阳离子纳米颗粒在储存过程中可以自聚集,我们建议将其负载浓度保持在尽可能低的水平,以尽量减少它们对球体形成的潜在影响。任选地,纳米颗粒悬浮液可以在使用前过滤(0.2μm)或通过离心(10,000× g,5分钟)清除,以从悬浮液中除去所有聚集物。
虽然BioCAD和HMI软件是针对所呈现的生物打印机的,但该协议适用于其他生物打印机,因为提供了生物墨水的制备,组装,标准墨盒的填充以及多孔水凝胶支架的设计。此外,对于不同的基于挤出的生物打印机,印刷速率和温度等生物打印参数应具有可比性。印刷压力和支柱直径取决于针类型和直径,生物墨水成分,温度和产生的粘度,但它们可以作为优化印刷参数的起点,以使用不同的生物打印机使用基于GelMA的生物墨水,尽管一些生物打印机使用纺锤而不是气压来挤出生物墨水50。
关键步骤和故障排除。 其中一个关键步骤是选择O2探针,这是基于以下考虑因素:首先,可用的荧光显微镜设置(即兼容的激发光源,用于激发和发射的滤光片,相机灵敏度和光谱透射率以及物镜的数值孔径),这可以限制可用探针的数量与其光稳定性的关系, 亮度和潜在的光毒性。同样重要的是要注意,某些类型的浸油(在油浸物镜的情况下)会干扰红色和红外荧光信号。我们认为光稳定性测试非常重要,必须在初始设置和初步测试期间进行。必须考虑荧光通道和不同染料之间的潜在光谱串扰。实际上,在方案优化51期间,必须在方案优化期间评估O2探针和其他所选染料相对于特定细胞模型的潜在暗毒性和光诱导毒性。纳米颗粒的具体问题可能是它们的自聚集,这可以通过优化其工作浓度,染色介质的组成(例如,血清含量),纳米颗粒在与介质混合之前的超声处理或通过使用O2探针预染色和洗涤的细胞进行球体形成而不是在球体形成和压实过程中的探针加载来缓解。
我们没有观察到与所描述的球体模型的光穿透深度相关的问题,但是在选择比例强度信号,球体和生物制造结构体(组织移植物)的大小以及使用相应染料优化细胞染色时必须考虑这一点。与其他红色/蓝色或绿色发射荧光生物传感器探针相比,具有紧密匹配的红色和近红外发射波长的MMIR1探针有望提供最低的背景和最佳的组织光穿透性。
比率图像的生产和处理(以及潜在的光谱解混合或反卷积)可以在供应商提供的软件或开源选项中完成,例如ImageJ,Fiji52,53,napari(https://napari.org),MATLAB等。关键步骤是减去背景并测量线性范围内的信号强度变化。
O2探针的校准:鱼藤酮和抗霉素A是线粒体电子传递链复合物I和III的抑制剂,分别阻断细胞呼吸54,55,15和诱导球体中O2梯度的耗散及其与环境O2的平衡。因此,改变环境O2浓度(即20%、15%、10%、5%、2.5%、1%O2%、0%O2)将允许对O2敏感探针在细胞中的成比例强度或磷光寿命进行校准。通常,O2控制的培养箱无法达到绝对的0%O2,并且在某些情况下,需要快速测试探针对脱氧的响应。在这种情况下,必须向样品中加入25-100μg/ mL葡萄糖氧化酶或Na2SO3 / K2HPO4混合物(每种化合物50mg / mL,在蒸馏水中加入10x溶液)。重要的是,如果细胞系具有显着程度的非线粒体O2消耗,则在进行抑制呼吸和校准实验时考虑这一点。
局限性和未来研究。 所提出的方法和一般比率检测的主要局限性是将观察到的比率水平校准和转换为实际的O2 水平,由于硬件和用户图像采集设置的固有差异,使得比率校准仪器和电池特定。重要的是,对于宽视场荧光显微镜和所述设置,比率图像反映的是组合投影而不是理想的光学切片,并且O2 校准没有意义。另一方面,我们表明,半定量比率测量提供了从各种来源产生的球体的统计显着且易于测量的比较表型,并且在氧化方面存在差异。
未来研究为实时3D对象(如SPIM,光片,theta,双光子和发光寿命成像)设计的更易于访问和负担得起的显微镜方法,结合机器学习56,57,58,59,19,将有助于将多参数O2 成像带入更定量的应用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了根特大学特别研究基金赠款(BOF/STA/202009/003)和欧盟FP7驱虫蚊帐计划“Chebana”的支持,赠款协议号为264772(AVK)。可根据要求提供数据。用于生物打印的G代码可供共享。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3cc Cartridge, UV secure, luer lock | RegenHU | C-033CC-UV | Also available from CelIink and others |
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | N/A | Bioprinter equiped with an extrusion based printhead, heating mantle, UV-LED curing lamp, 3D Discovery HMI software (CAD/CAM software with direct machine control) and BioCAD software (version 1.1-12) |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | Used as inhibitor of complex III of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
B-Braun Tip Cap, luer lock | RegenHU | TC-BB-B | Also available from Regemat, Cellink and others |
Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment, sterile | Greiner bio-one | 627861 | For microscopy of bioprinted spheroids |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1M stock solution, 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Also available from Lonza and others |
Endothelial Growth SupplementMix | PromoCell | C-39216 | Also available from Lonza and others |
FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | Used as mitochondrial uncoupler |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma |
GelMA | N/A | N/A | GelMA was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] but are also available from Xpect Inx |
Glucose-oxidase from Aspergillus nige (10000 u) | Sigma-Aldrich | G7141 | Used to test the response of probe to deoxygenation |
GlutaMAX 100x Supplement | Gibco | 35050-038 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 2mM) |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10mM) |
Hoechst 34580 | Invitrogen (Life Technologies) | H21486 | Also available from Sigma, BDBiosciences and others |
Human dental pulp stem cells (hDPSC) | Lonza | PT-5025 | Also available from ATCC or other vendors |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2517 | Also available from ATCC or other vendors |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) | Merck | 4873 | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
Li-TPO | N/A | N/A | Li-TPO-L was synthesized by the PBM group (Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent) [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] but comparable photo-initiators are available from Sigma |
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium | Gibco | 32561-029 | Also available from Sigma and others |
Micro-patterned 3D-printed PDMS stamps, wells with a diameter 400 µm, thickness, total well numbers 1585 | Self-fabricated | These stamps were self-fabricated by the Centre for Microsystems Technology (Professor Dr Jan Vanfleteren, University of Gent) but can also be obtained commercially from Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit) | |
Na2SO3 (sodium sulfite) | Sigma-Aldrich | 239321-500G | For preparation of sodium sulfite solution (5 mg / mL Na2SO3 and 5 mg / mL KH2PO4). Prepare fresh from 10x concentrated stock solution daily. |
O2 probes: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+ | N/A | N/A | Can be prepared ‘in-house’ using commercially available dyes, polymers and precipitation method [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Some nanoparticles are available commercially as discussed in [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ] |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma . Apply in dilution 1:100 |
Petri dishes, sterile | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Piston for 3cc cartridge | RegenHU | P-03CC-UV | Also available from Cellink, Regemat and others |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07mg/mL Collagen and 0.03mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | Used as inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, blocking cell respiration |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SYTOX Green | Invitrogen (Life Technologies) | S7559 | Also available from Sigma, Promega and others |
Taper tip 22 gauge (conical PE needle | Amada Myachi Europe | 22K62222 | Similar products are also available from RegenHU, Cellink, Regemat and others |
Tissue culture flask (75 cm2) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
- Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35 (2015).
- Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
- Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
- Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
- Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
- Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
- Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
- Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070 (2021).
- Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
- Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
- Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499 (2021).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
- Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
- Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
- Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
- Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983 (2019).
- Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782 (2021).
- Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853 (2017).
- Roussakis, E., et al.
Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019). - Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
- Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
- Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
- Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
- Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
- Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171 (2014).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
- Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402 (2015).
- Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
- Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
- Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011 (2015).
- De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484 (2020).
- Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
- Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
- Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
- Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
- Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420 (2020).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H.
Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017). - Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
- Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
- Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
- Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142 (2021).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308 (2007).
- Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
- Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140 (2021).
- Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).