初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング
Summary
ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。
Abstract
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl–)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。
Introduction
嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。培養技術の最適化のおかげで、患者由来の初代HNE細胞をRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi)で条件付きで再プログラムし、増幅し、微多孔性フィルター5,6上の気液界面(ALI)条件下で擬似層状上皮に分化させることができる5,6。HNE培養のための多数の培養プロトコールが存在し(市販、無血清、「自家製」、「フィーダー細胞との共培養など)、培地および培養条件の選択は、増殖、細胞集団の分化および上皮機能に影響を与えることが記載されている7、8。ここでのプロトコルは、CFTR機能アッセイのためにALIで分化される多数のHNE細胞を首尾よく得ることを可能にする、単純化されたフィーダーフリーのROCKi増幅法を提示する。
我々は、分化したHNE細胞において、CFTRモジュレーターによる48時間治療がCFTR依存性Cl– 電流の電気生理学的補正を誘導するのに十分であり、 インビトロで 観察される補正が患者の臨床的改善と相関し得ることを実証した9。したがって、HNE細胞は、基礎的なCF研究だけでなく、患者固有のCFTRモジュレーター試験を伴う前臨床試験にも適切なモデルである。個別化治療のこの文脈において、プロトコールの目標は、我々の条件で増殖したCF患者由来の凍結保存HNE細胞がCFTR補正研究のための適切なモデルであり、新鮮および凍結融解細胞からのCFTR依存性Cl- 輸送を比較する場合、同様の結果が期待できることを検証することであった。この研究はまた、二重療法および三重療法を使用する場合の異なるCFTRモジュレーターの有効性を評価した。
Protocol
Representative Results
Discussion
個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。
Materials
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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