Cellules épithéliales nasales humaines primaires : la biobanque dans le contexte de la médecine de précision
Summary
Nous décrivons ici l’isolement, l’amplification et la différenciation des cellules primaires de l’épithélium nasal humain (HNE) à l’interface air-liquide et un protocole de biobanque permettant de congeler avec succès puis de décongeler l’HNE amplifiée. Le protocole analyse les propriétés électrophysiologiques des cellules HNE différenciées et la correction de la sécrétion de chlorure liée au CFTR sur différents traitements modulateurs.
Abstract
Les cellules épithéliales nasales humaines (HNE) sont faciles à prélever par simple brossage nasal non invasif. Les cellules HNE primaires dérivées du patient peuvent être amplifiées et différenciées en un épithélium pseudo-stratifié dans des conditions d’interface air-liquide pour quantifier le transport cyclique du chlorure (Cl–) médié par l’AMP en tant qu’indice de la fonction de régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Si des étapes critiques telles que la qualité du brossage nasal et la densité cellulaire lors de la cryoconservation sont effectuées efficacement, les cellules HNE peuvent être biobancées avec succès. De plus, les études de courant de court-circuit démontrent que la décongélation ne modifie pas de manière significative les propriétés électrophysiologiques des cellules HNE et leur réponse aux modulateurs CFTR. Dans les conditions de culture utilisées dans cette étude, lorsque moins de 2 x 106 cellules sont congelées par cryoviale, le taux d’échec est très élevé. Nous recommandons de congeler au moins 3 x 106 cellules par cryovial. Nous montrons que les bithérapies combinant un correcteur CFTR avec un potentiateur CFTR ont une efficacité de correction comparable pour l’activité CFTR dans les cellules HNE homozygotes F508del. La trithérapie VX-445 + VX-661 + VX-770 a significativement augmenté la correction de l’activité CFTR par rapport à la bithérapie VX-809 + VX-770. La mesure de l’activité CFTR dans les cellules HNE est un biomarqueur préclinique prometteur utile pour guider le traitement par modulateur CFTR.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est un trouble autosomique récessif résultant de mutations du gène régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) conduisant à l’absence ou au dysfonctionnement de la protéine CFTR, un canal anionique situé à la surface apicale de l’épithélium 1,2. Les progrès récents dans le traitement CFTR ont amélioré le pronostic de la maladie, et les derniers médicaments approuvés combinant des correcteurs CFTR et des potentialisateurs CFTR ont conduit à des améliorations majeures de la fonction pulmonaire et de la qualité de vie des patients atteints de mucoviscidose porteurs de la mutation p.Phe508del la plus fréquente (F508del)3,4. Malgré ces progrès thérapeutiques prometteurs, environ 10% des patients atteints de mucoviscidose ne sont pas éligibles car ils sont porteurs de mutations incupérables par ces modulateurs CFTR. Pour ces patients, il est nécessaire de tester d’autres médicaments ou combinaisons de médicaments pour trouver la combinaison la plus efficace pour des mutations spécifiques, soulignant l’importance des thérapies personnalisées.
Les cellules épithéliales nasales humaines (HNE) sont faciles à prélever par brossage nasal simple et non invasif et permettent de quantifier le transport cyclique du chlorure (Cl−) médié par l’AMP en tant qu’indice de la fonction CFTR. Les cellules HNE donnent un modèle précis des voies respiratoires humaines, mais leur durée de vie est limitée en culture. Grâce à l’optimisation des techniques de culture, les cellules HNE primaires dérivées du patient peuvent être reprogrammées conditionnellement avec un inhibiteur de kinase rho-associé (ROCKi), amplifiées et différenciées en un épithélium pseudo-stratifié dans des conditions d’interface air-liquide (ALI) sur des filtres microporeux 5,6. Il existe de nombreux protocoles de culture pour la culture de l’HNE (disponibles dans le commerce, sans sérum, « fait maison », co-culture avec des cellules nourricières, etc.), et le choix des milieux et des conditions de culture a été décrit comme ayant un impact sur la croissance, la différenciation de la population cellulaire et la fonction épithéliale 7,8. Le protocole présente ici une méthode d’amplification ROCKi simplifiée, sans chargeur, qui permet d’obtenir avec succès un grand nombre de cellules HNE qui sont ensuite différenciées à ALI pour les tests de fonction CFTR.
Nous avons démontré que, dans les cellules HNE différenciées, un traitement de 48 h avec des modulateurs CFTR est suffisant pour induire une correction électrophysiologique du courant Cl– dépendant du CFTR et que la correction observée in vitro peut être corrélée à l’amélioration clinique du patient9. Les cellules HNE représentent donc un modèle approprié non seulement pour la recherche fondamentale sur la FK, mais aussi pour les études précliniques avec des tests de modulateur CFTR spécifiques au patient. Dans ce contexte de thérapie personnalisée, l’objectif du protocole était de valider que les cellules HNE cryoconservées de patients atteints de mucoviscidose, cultivées dans nos conditions, constituaient un modèle approprié pour les études de correction CFTR, et des résultats similaires pouvaient être attendus lors de la comparaison du transport Cl– dépendant du CFTR à partir de cellules fraîches et congelées-décongelées. L’étude a également évalué l’efficacité de différents modulateurs CFTR lors de l’utilisation de thérapies doubles et triples.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de cellules épithéliales nasales dérivées du patient comme substituts des cellules épithéliales bronchiques humaines (HBE) pour mesurer l’activité CFTR dans le contexte de la médecine personnalisée a été proposée alors que l’HNE reproduit les propriétés des cellules en culture 9,11. Le grand avantage des cultures cellulaires HNE par rapport aux cultures cellulaires HBE est qu’elles sont facilement et non invasivement échantill…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions chaleureusement tous les patients et leurs familles pour leur participation à l’étude. Ce travail a été soutenu par des subventions de Français’Association Vaincre la Mucoviscidose; Français Association ABCF 2 et Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D’anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
