यहां, हम अवशिष्ट अंडे के मलबे के क्षेत्र संग्रह के आधार पर तितली आबादी के गैर-आक्रामक आनुवंशिक नमूने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसका उपयोग प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को सामुदायिक विज्ञान की भागीदारी के लिए व्यापक समूहों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
वैश्विक कीट गिरावट में तेजी जारी है। कई टैक्सों की समझ को आगे बढ़ाने और मौजूदा ज्ञान अंतराल को संबोधित करने के लिए प्रभावी आनुवंशिक नमूनाकरण की गंभीर रूप से आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल जनसंख्या आनुवंशिक संरचना या डीएनए बारकोडिंग विश्लेषण के लिए दुर्लभ तितलियों के गैर-विनाशकारी नमूने के लिए एक प्रदर्शित विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए सफल जीन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च मात्रा और गुणवत्ता वाले डीएनए उत्पन्न करने के लिए हैच तितली ओवे के कोरियन का उपयोग करता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब अन्य ऊतक नमूना तकनीक अव्यावहारिक या अनुपलब्ध होती है। जबकि लेपिडोप्टेरान के लिए विकसित किया गया था, फिर भी इसे आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह विशेष रूप से उपयोग में आसानी के साथ डिजाइन किया गया था ताकि विभिन्न अनुभव और कौशल स्तरों के व्यक्तियों, जैसे सामुदायिक वैज्ञानिकों, संरक्षण चिकित्सकों और छात्रों द्वारा व्यापक कार्यान्वयन को अधिकतम करने में मदद मिल सके, और व्यापक जनसंख्या नमूनाकरण की सुविधा के लिए बड़े भौगोलिक क्षेत्रों में उपयोग किया जा सके। उत्पन्न डेटा टैक्सोनोमिक और लिस्टिंग निर्णयों, संरक्षण और प्रबंधन कार्यों को सूचित करने और बुनियादी पारिस्थितिक अनुसंधान को बढ़ाने में मदद कर सकता है।
दुर्लभ, गिरावट और / या सूचीबद्ध कीट टैक्सा का प्रभावी जनसंख्या आनुवंशिक नमूनाकरण अक्सर संरक्षण और प्रबंधन कार्यों को सूचित करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण होता है। कई आनुवंशिक विश्लेषणों के लिए घातक या हानिकारक ऊतक नमूनाकरण विधियों का नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, ये विधियां अवांछनीय हैं या अनुमति नहीं है क्योंकि वे कमजोर मौजूदा आबादी को नुकसान पहुंचा सकते हैं या व्यवहार और फिटनेस को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। विभिन्न गैर-घातक या गैर-आक्रामक नमूनाकरण तकनीकें जिनमें ऊतक शामिल हैं जैसे कि पूरे पैर, एंटीनल या विंग क्लिपिंग, लार्वा एक्सुविया, या रक्षात्मक स्राव से हेमोलिम्फ और अन्य उत्पाद, जैसे कि फ्रैस, कीट आनुवंशिक अनुसंधान के लिए उपयुक्त रहे हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . इन विभिन्न ऊतक नमूना तकनीकों की समग्र व्यवहार्यता और प्रयोज्यता जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी, व्यवहार, आकार और फोकल जीव, स्थिति और सामग्री एकत्र करने वाले व्यक्तियों की दुर्लभता के आधार पर काफी भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पूरे पैर या उपांग क्लिपिंग को एक उपयुक्त जीवन स्तर के कई व्यक्तियों के अस्थायी कैप्चर और सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, आमतौर पर अनुभवी कर्मियों द्वारा। इसी तरह, ऊतक स्रोत, जैसे कि लार्वा एक्सुविया या फ्रैस, केवल तभी व्यावहारिक होने की संभावना है जब जीव कैद में हों या अस्थायी रूप से पर्याप्त अवधि के लिए रखे गए हों।
जनसंख्या स्तर पर पूछे जाने वाले शोध प्रश्नों के लिए, जैसे कि संभावित टैक्सोनोमिक भेदभाव या आनुवंशिक संरचना से संबंधित, व्यापक अस्थायी या भौगोलिक पैमाने (यानी, क्षेत्रीय या महाद्वीपीय) पर नमूनाकरण अक्सर आवश्यक होता है। नतीजतन, कुछ गैर-आक्रामक ऊतक स्रोत पूरी तरह से अव्यावहारिक हो सकते हैं या मात्रा में एकत्र करने के लिए कम से कम अक्षम हो सकते हैं। ऐसे पैमानों पर नमूना संग्रह भी व्यक्तिगत शोधकर्ताओं या यहां तक कि छोटी फील्ड टीमों के लिए तार्किक या वित्तीय रूप से अव्यावहारिक या निषेधात्मक हो सकता है। जबकि इन चुनौतियों में से कई को संबोधित करने और बड़े डेटा-संचालित संग्रह में तेजी लाने में मदद करने के लिए अनुसंधान समुदाय द्वारा सामुदायिक वैज्ञानिकों की प्रत्यक्ष भागीदारी को तेजी से अपनाया गया है, गैर-विनाशकारी, गैर-आक्रामक, या ईडीएनए नमूनाकरण10,11,12 से जुड़े अध्ययनों के लिए अपनाना सीमित है।
इन संभावित सीमाओं में से कुछ को दूर करने में मदद करने के लिए, हमने प्रदर्शित किया कि हैच तितली ओवे से कोरियन प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए सफल जीन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च मात्रा और गुणवत्ता वाले डीएनए का उत्पादन कर सकता है। हमने बाद में इस तकनीक13 का उपयोग करके विभिन्न संग्रह प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। इस पायलट कार्य ने आगे पद्धतिगत शोधन के आधार के रूप में कार्य किया। यह पत्र सामुदायिक वैज्ञानिकों और अन्य गैर-विशेषज्ञ कर्मियों के लिए परिणामी सरल लेकिन व्यापक संशोधित क्षेत्र संग्रह प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल भविष्य के संरक्षण कार्यों को सूचित करने और अमेरिकी लुप्तप्राय प्रजाति अधिनियम के तहत संभवतः सूचीबद्ध होने के संघीय निर्धारण में मदद करने के लिए फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली (कैलोफ्रिस इरस) के एक श्रृंखला-व्यापी जनसंख्या संरचना विश्लेषण का हिस्सा है। यद्यपि कुछ गैर-आक्रामक तरीकों की तुलना में संभावित रूप से अधिक श्रम-गहन है, आवश्यक जीव संपर्क की कमी और उपयोग में आसानी इसे एक संभावित व्यवहार्य मॉडल बनाती है जिसे आम कीड़ों और संरक्षण चिंता दोनों के चयन को लक्षित करने वाले अन्य जनसंख्या आनुवंशिक अनुसंधान कार्यक्रमों पर लागू किया जा सकता है, जो हाल ही में हैच किए गए अप्सराओं या लार्वा से अवशिष्ट अंडे के मलबे को पीछे छोड़ देते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल भाषा विशेष रूप से लाइकेनिडे परिवार में तितलियों के लिए विकसित की गई थी और यहां सामुदायिक वैज्ञानिकों या अन्य व्यक्तियों (जैसे, एजेंसी जीवविज्ञानी, इंटर्न) के रूप में परिभाषित गैर-विशेषज्ञों द्वारा उपयोग के लिए सीमित एंटोमोलॉजिकल अनुभव के साथ विकसित की गई थी।
यह प्रोटोकॉल जनसंख्या आनुवंशिक संरचना या डीएनए बारकोडिंग विश्लेषण के लिए दुर्लभ तितलियों के गैर-विनाशकारी नमूने के लिए एक क्षेत्र विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल के समग्र लाभ विशेष रूप से सामुदायिक वैज्ञानिकों, संरक्षण चिकित्सकों और छात्रों जैसे अलग-अलग अनुभव और कौशल स्तरों के व्यक्तियों द्वारा व्यापक कार्यान्वयन को अधिकतम करने में मदद करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इनमें अपेक्षाकृत कम समग्र लागत, आसानी से प्राप्त आपूर्ति और उपकरण, कई अत्यधिक जटिल चरणों के बिना एक सरल और सुलभ विधि और एक व्यापक भौगोलिक क्षेत्र पर आसान तैनाती शामिल है। यह अवशिष्ट कार्बनिक पदार्थ को भी लक्षित करता है जो अस्थायी रूप से पकड़ने या हेरफेर करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, और इस प्रक्रिया में, आनुवंशिक नमूने प्राप्त करने के लिए जीवित जीवों को संभावित रूप से नुकसान पहुंचाता है। इसके अलावा, यह पारंपरिक फेनोलॉजी या किसी विशेष जीवन स्तर के जीवनकाल से परे नमूना संग्रह के लिए उपलब्ध संभावित अवधि का विस्तार करता है, नमूना संख्याओं को अधिकतम करने में मदद करने के लिए लचीलापन और समग्र संग्रह के अवसर को बढ़ाता है।
जबकि इस प्रयास के लिए फोकल टैक्सन फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली था, जो एक व्यापक लेकिन घटते आवास विशेषज्ञ थे, इस प्रोटोकॉल को संरक्षण चिंता सहित कई अन्य कीड़ों पर अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। इसी तरह, जबकि प्रोटोकॉल आनुवंशिक सामग्री के स्रोत के रूप में हैच किए गए अंडे के संग्रह को लक्षित करता है, इसे आसानी से अन्य, संभावित रूप से अधिक पारंपरिक नमूनों (जैसे, पैर, पंख के टुकड़े, एंटीनल क्लिप) या यहां तक कि पूरे जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह पहलू प्रोटोकॉल की एक संभावित सीमा भी है। यद्यपि अधिकांश चरणों को अपेक्षाकृत सरल और त्वरित रूप से पूरा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, हैच अंडे के लिए लार्वा मेजबान पौधों के व्यापक रूप से खोज पैच, जो व्यक्तिगत रूप से आमतौर पर <1.0 मिमी व्यास के होते हैं, समय और श्रम-गहन हैं। बहरहाल, इस तरह की व्यापक नमूना गतिविधि विशेष रूप से सामुदायिक वैज्ञानिकों जैसे प्रतिभागियों के एक बड़े नेटवर्क के लिए आदर्श है।
अन्य क्षेत्र-आधारित परियोजनाओं के साथ, सावधानीपूर्वक तैयारी आवश्यक है। इसमें यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक आपूर्ति की पूरी सूची का संचालन करना शामिल है कि कोई आइटम गायब नहीं है, कोई आवश्यक तैयारी कार्य पूरा हो गया है, और वे अच्छी तरह से व्यवस्थित, सुरक्षित रूप से पैक किए गए हैं, और क्षेत्र तैनाती के लिए तैयार हैं। इसके अलावा, सभी क्षेत्र कर्मियों, विशेष रूप से ऊतक संग्रह का संचालन करने वालों को किसी भी संग्रह घटना से पहले संग्रह प्रोटोकॉल की विस्तार से समीक्षा करनी चाहिए और परियोजना की देखरेख करने वाले व्यक्तियों को किसी भी प्रश्न को संबोधित करना चाहिए। एक बार क्षेत्र में, प्रोटोकॉल के नमूना संग्रह भाग को विस्तार से सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इसमें यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी ओवा का पता लगाना और सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना शामिल है कि वे हैच किए गए हैं और इस प्रकार संग्रह के लिए उपयुक्त हैं, पूरी तरह से सफाई करना, नमूना घटनाओं के बीच ऊतक कैरीओवर को कम करने में मदद करने के लिए दस्ताने को बदलना, और यह सुनिश्चित करना कि ऊतक के नमूने प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर लाइसिस बफर में पूरी तरह से डूबे हुए हैं। अंत में, सटीक और विस्तृत डेटा रिकॉर्ड करना आवश्यक है, जिसमें माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से असाइन किए गए अद्वितीय आईडी लेबल को विशिष्ट नमूने और अन्य सभी प्रासंगिक संग्रह जानकारी के साथ जोड़ना शामिल है। हालांकि यह कदम वैज्ञानिक अनुसंधान में नियमित है, इसे अक्सर सामुदायिक विज्ञान दर्शकों के लिए पूरी तरह से स्पष्ट और प्रबलित करने की आवश्यकता होती है।
यहां, हम छोटे, दुर्लभ और खतरे वाली प्रजातियों से गैर-घातक नमूना संग्रह के लिए सामुदायिक वैज्ञानिकों के संभावित लाभ का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, किसी भी परिणामी आनुवंशिक डेटा का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखने के लिए कुछ संभावित सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, जबकि एक ही पैच से नमूने पूल करने से पता लगाने के लिए पर्याप्त डीएनए पुनर्प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है, यह संभावित रूप से हेटरोजाइगोसिटी का भी परिचय देता है। इसके अलावा, जैसा कि प्रोटोकॉल में हैच ओवे से कोरियन एकत्र करना शामिल है, केवल मादा तितलियों, माता-पिता के डीएनए का प्रतिनिधित्व करते हुए, आबादी के भीतर नमूना लिया जा सकता है। बहरहाल, जैसा कि सी इरस के लिए कोई पिछला जनसंख्या-स्तरीय आनुवंशिक डेटा उपलब्ध नहीं था, परिणामस्वरूप प्राप्त अंतर्दृष्टि केवल प्रजातियों के संरक्षण और प्रबंधन को लाभ पहुंचा सकती है। उदाहरण के लिए, जबकि जनसंख्या संरचना का पर्याप्त रूप से आकलन करने के लिए एक गहन, विस्तृत अध्ययन डिजाइन और सावधानीपूर्वक मार्कर चयन की आवश्यकता होगी, यहां उल्लिखित नमूना प्रोटोकॉल और साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट 1 (सीओ 1) डीएनए बारकोडिंग का उपयोग दुर्लभ या संकटग्रस्त टैक्सा की घटना का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित गैर-घातक नमूने से डीएनए अनुक्रमण की उपयोगिता और अनुप्रयोग की अतिरिक्त चर्चा स्टोरर एट द्वारा विस्तृत है। अल.14.
आनुवंशिक विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करने के प्राथमिक लक्ष्य से परे, प्रोटोकॉल यह भी जोर देता है कि प्रतिभागी सभी क्षेत्र स्थलों, संग्रह स्थानों, लार्वा मेजबान पौधों की विस्तृत डिजिटल तस्वीरें लेते हैं, और आसपास के निवास स्थान के किसी भी अन्य तत्व जो प्रासंगिक हो सकते हैं। इस तरह के प्रलेखन एक सामान्य निवास मूल्यांकन प्रदान करने में मदद करते हैं जो मौजूदा साइट स्थितियों जैसे प्लांट फेनोलॉजी, मेजबान संसाधन घनत्व और प्रबंधन इतिहास (जैसे, हाल ही में निर्धारित आग) को चित्रित करने के लिए उपयोगी है। ऐसी जानकारी विशेष रूप से उन परियोजनाओं के लिए उपयोगी है जहां अधिक विस्तृत पर्यावरणीय तुलना को सक्षम करने के लिए व्यापक अस्थायी अवधि में क्षेत्र के नमूने लिए जाते हैं।
अंत में, जैसा कि वैश्विक कीट गिरावट में तेजी जारी है, विस्तारित प्रजातियों के मूल्यांकन और निगरानी प्रयासोंकी गंभीर रूप से आवश्यकता है। सामुदायिक वैज्ञानिकों, छात्रों (जैसे, अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा इंटर्न और अध्येताओं) और संरक्षण चिकित्सकों से अधिक व्यापक भागीदारी जुड़ाव का उपयोग डीएनए नमूनों सहित कई प्रकार के व्यापक डेटा संग्रह के लिए तेजी से व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न डेटा के कई संभावित उपयोग हैं। इनमें संरक्षण कार्यों (जैसे, योजना, वसूली और प्रबंधन) को सूचित करने में मदद करना, निर्णय या प्रजातियों की स्थिति के आकलन को सूचीबद्ध करना, और पारिस्थितिक, जनसंख्या और वर्गीकरण अनुसंधान शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डेविड कुथेरेल, अमांडा डिलन, स्टीव फुलर, नील गिफोर्ड, हेदी होल्मन, डीन जू, सैली जू, डैनियल कैनेडी, जेनेवीव कोज़क, रेबेका लोंगेनेकर, मॉरीन मैकक्लंग, मैट मोरन, रॉबिन निवर, ब्रेंडा स्मिथ, हंटर ट्रोवब्रिज और जेसप वीचेल्ट को परियोजना के विभिन्न पहलुओं में मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जिसमें रसद, समन्वय, अनुमति और / या नमूना संग्रह शामिल हैं। इस शोध को वन्यजीव प्रबंधन संस्थान (अनुदान एसए 2021-01) द्वारा प्रशासित अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा (संघीय पुरस्कार पहचान संख्या एफ 20एसी 00356) से अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।
14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
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Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
packing material Amount per deployable unit: as needed |