Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules
Summary
Un protocole de laboratoire complet et un flux de travail d’analyse sont décrits pour un test colorimétrique rapide, rentable et simple basé sur les cellules afin de détecter les éléments neutralisants contre AAV6.
Abstract
Les virus adéno-associés recombinants (rAAV) se sont avérés être un vecteur sûr et efficace pour le transfert de matériel génétique afin de traiter divers problèmes de santé en laboratoire et en clinique. Cependant, les anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides AAV posent un défi permanent pour l’administration réussie de thérapies géniques à la fois dans les grands modèles expérimentaux animaux et dans les populations humaines. Un dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte contre l’AAV est nécessaire pour assurer l’efficacité des thérapies géniques à base d’AAV en tant qu’outil de recherche et en tant qu’agent thérapeutique cliniquement viable. Ce protocole décrit un test colorimétrique in vitro pour détecter les facteurs neutralisants contre le sérotype 6 de l’AAV (AAV6). Le test utilise la réaction entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et son substrat NBT / BCIP, qui génère une tache violette quantifiable insoluble lors de la combinaison.
Dans ce protocole, les échantillons de sérum sont combinés avec un AAV exprimant l’AP et incubés pour permettre une activité neutralisante potentielle. Le mélange de sérum viral est ensuite ajouté aux cellules pour permettre la transduction virale de tous les AAV qui n’ont pas été neutralisés. Le substrat NBT/BCIP est ajouté et subit une réaction chromogène, correspondant à la transduction virale et à l’activité neutralisante. La proportion de surface colorée est quantifiée à l’aide d’un outil logiciel gratuit pour générer des titres neutralisants. Ce test montre une forte corrélation positive entre la coloration et la concentration virale. L’évaluation d’échantillons de sérum de moutons avant et après l’administration d’un AAV6 recombinant a entraîné une augmentation spectaculaire de l’activité neutralisante (augmentation de 125 à >10 000 fois). Le test a montré une sensibilité adéquate pour détecter l’activité neutralisante dans >1:32 000 dilutions sériques. Ce test fournit une méthode simple, rapide et rentable pour détecter les NAbs contre les AAV.
Introduction
Les virus adéno-associés (AAV) sont de plus en plus utilisés comme vecteurs pour l’administration de thérapies géniques à des traitements d’essai pour divers problèmes de santé qui ont un impact sur les systèmes cardiovasculaire, pulmonaire, circulatoire, oculaire et nerveux central1,2,3,4,5. La popularité des vecteurs AAV en tant que plate-forme de thérapie génique de premier plan découle de leur profil d’innocuité positif, de leur expression transgénique à long terme et de leurs tropismes spécifiques aux tissus1,6. Les résultats positifs des études animales ont ouvert la voie à plus de cinquante essais cliniques de thérapie génique AAV qui ont atteint avec succès leurs critères d’efficacité7, ainsi qu’à la sortie du premier médicament de thérapie génique AAV disponible dans le commerce approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis8. Après les premiers succès, l’AAV a continué de gagner du terrain dans les secteurs de la recherche fondamentale et clinique en tant que vecteur de choix et est actuellement la seule thérapie génique in vivo approuvée pour une utilisation clinique aux États-Unis et en Europe9. Néanmoins, la présence d’anticorps neutralisants préexistants (NAbs) contre les capsides vectorielles AAV reste un obstacle à la recherche préclinique et à l’efficacité des essais cliniques. Les NAbs sont présents dans les populations humaines et animales naïves et inhibent la transduction des gènes après l’administration in vivo d’un vecteur AAV1. La séropositivité à l’AAV est un critère d’exclusion pour la plupart des essais de thérapie génique et, par conséquent, le dépistage préliminaire de l’immunité de l’hôte est crucial en laboratoire et en clinique. L’établissement d’un test capable de détecter la présence de NAbs contre l’AAV est une étape essentielle dans le pipeline de tout projet de recherche basé sur la thérapie génique AAV. Ce rapport se concentre sur AAV6 qui a intéressé les chercheurs en raison de sa transduction efficace et sélective dans les muscles striés (cœur et muscle squelettique)1,10,11,12. La thérapie génique est considérée comme une stratégie prometteuse pour cibler le cœur, car il est difficile de cibler spécifiquement le cœur sans procédures invasives à cœur ouvert.
L’activité neutralisante est généralement déterminée à l’aide d’un test d’inhibition de la transduction in vitro ou in vivo à base de cellules. In vivo Les tests NAb impliquent généralement l’administration de sérum d’un sujet testé (par exemple, humain ou gros animal) à des souris, suivie d’un AAV avec un gène rapporteur, suivi d’un test d’expression du gène rapporteur ou de l’antigène correspondant. Les essais in vitro déterminent les titres de NAb en incubant du sérum ou du plasma d’un humain ou d’un gros animal dans des dilutions en série avec un AAV recombinant (rAAV) qui exprime un gène rapporteur. Les cellules sont infectées par le mélange sérum/virus, et la mesure dans laquelle l’expression du gène rapporteur est inhibée est évaluée par rapport aux témoins. Les tests in vitro sont largement utilisés pour le dépistage du NAb en raison de leur coût comparativement inférieur, de la rapidité des tests et de la plus grande capacité de normalisation et de validation13,14 par rapport aux essais in vivo. On rapporte souvent que les essais in vivo ont une plus grande sensibilité15,16, mais la même allégation a été faite concernant les essais in vitro14,17.
À ce jour, les tests NAb in vitro ont principalement utilisé la luminescence (luciférase) comme gène rapporteur pour détecter la neutralisation. Bien qu’une méthode basée sur la lumière ait du mérite dans de nombreux contextes, un test colorimétrique / chromogène NAb peut être avantageux dans certaines circonstances. Des tests colorimétriques pour évaluer la neutralisation ont été utilisés avec succès pour d’autres virus tels que la grippe et l’adénovirus18,19. Leur attrait provient de leur simplicité, de leur coût inférieur et de l’exigence de ne disposer que d’appareils et d’outils de laboratoire quotidiens20. Les tests NAb qui utilisent un gène rapporteur basé sur la luminescence nécessitent des kits de substrat coûteux, un luminomètre et un logiciel correspondant pour l’analyse21. Ce test colorimétrique a l’avantage de ne nécessiter qu’un microscope optique et un substrat très bon marché. La déclaration de la sensibilité des tests colorimétriques par rapport aux tests luminescents a donné des résultats contradictoires. Une étude a suggéré que les tests ELISA basés sur la luminescence présentent une plus grande sensibilité et une reproductibilité comparable aux tests colorimétriques22, tandis qu’une autre a révélé que les tests ELISA basés sur la colorimétrie conféraient une plus grande sensibilité23. Ici, un protocole détaillé pour un test NAb in vitro contre l’AAV qui utilise la réaction chromogène entre un AAV codant pour un gène rapporteur de phosphatase alcaline (AP) et un substrat de tétrazolium bleu nitro / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) est fourni. Ce protocole étape par étape a été développé sur la base d’un rapport précédent qui utilisait un gène rapporteur hPLAP (phosphatase alcaline placentaire humaine) (AAV6-hPLAP) pour détecter l’activité neutralisante contre AAV24. Ce test est rentable, rapide, facile à configurer et nécessite un minimum de compétences techniques, d’équipement de laboratoire et de réactifs. De plus, la simplicité de ce test lui donne le potentiel d’être optimisé pour de larges applications sur différents types de cellules, de tissus ou de sérotypes viraux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport décrit un test colorimétrique qui évalue l’étendue de la neutralisation de l’AAV dans un échantillon de sérum donné en évaluant une réaction chromogène correspondant au degré de transduction virale in vitro. Le développement du protocole était basé sur la réaction chromogène connue entre l’enzyme phosphatase alcaline et nbT / BCIP, qui a été largement utilisée comme outil de coloration pour la détection de cibles protéiques dans des applications telles que l’immunohistochi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une subvention de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale à JRM et CJT (ID 1163732) et en partie par le programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement victorien. SB est soutenu par une bourse de doctorat conjointe baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. KLW est soutenu par la Shine On Foundation et une future bourse Future Leader de la National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM est soutenu par une bourse de recherche principale du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (ID 1078985).
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
| 75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
| 96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
| Aluminium foil | |||
| Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Cell and tissue culture safety cabinet | |||
| Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Haemocytometer | |||
| High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cells | ATCC | ||
| ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
| Oven | For a 65 °C incubation | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | |||
| Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
| Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
| Water bath |
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