JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Förster Resonans Energy Transfer Mapping: En ny metode til at belyse globale strukturelle træk

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

Undersøgelsen beskriver metoden til FRET-kortlægning, herunder valg af mærkningssteder, valg af farvestoffer, erhvervelse og dataanalyse. Denne metode er effektiv til bestemmelse af bindingssteder, konformationsændringer og dynamiske bevægelser i proteinsystemer og er mest nyttig, hvis den udføres sammen med eksisterende 3D-strukturelle oplysninger.

Abstract

Förster resonans energioverførsel (FRET) er en etableret fluorescensbaseret metode, der anvendes til succesfuldt at måle afstande i og mellem biomolekyler in vitro såvel som i celler. I FRET vedrører effektiviteten af energioverførsel, målt ved ændringer i fluorescensintensitet eller levetid, afstanden mellem to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse af dynamik og konformationsændringer fra afstandene er blot nogle eksempler på anvendelser af denne metode til biologiske systemer. Under visse omstændigheder kan denne metode tilføje til og forbedre eksisterende røntgenkrystalstrukturer ved at give information om dynamik, fleksibilitet og tilpasning til bindende overflader. Vi beskriver brugen af FRET og tilhørende afstandsbestemmelse til at belyse strukturelle egenskaber gennem identifikation af et bindingssted eller orienteringen af dimerunderenheder. Gennem velovervejet valg af mærkningssteder og ofte anvendelse af flere mærkningsstrategier har vi med succes anvendt disse kortlægningsmetoder til at bestemme globale strukturelle egenskaber i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brugt FRET-kortlægningsmetoder til at identificere præproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformation af det bundne signalsekvensområde. Denne undersøgelse skitserer trinene til udførelse af FRET-kortlægningsundersøgelser, herunder identifikation af passende mærkningssteder, diskussion af mulige etiketter, herunder ikke-indfødte aminosyrerester, mærkningsprocedurer, hvordan man udfører målinger og fortolkning af dataene.

Introduction

For proteiner fører belysning af dynamik sammen med 3-dimensionel (3-D) strukturel viden til en forbedret forståelse af struktur-funktionsforhold mellem biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, såsom røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger en statisk struktur og kræver ofte bestemmelse af flere strukturer for at belyse aspekter af biomolekylebinding og dynamik1. Denne artikel diskuterer en løsningsbaseret metode til kortlægning af globale strukturelle elementer, såsom bindingssteder eller bindingsinteraktioner, der potentielt er mere forbigående og mindre lette at fange ved statiske metoder. Stærke kandidatsystemer til denne metode er dem, hvor en 3D-struktur tidligere er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfælde udnytter vi røntgenkrystalstrukturen i SecA-SecYEG-komplekset, en central aktør i proteinets generelle sekretoriske vej, til at kortlægge placeringen af et signalpeptidbindingssted ved hjælp af Förster resonansenergioverførsel (FRET) inden transport af præproteinet over membranen2. Manipulation af det biologiske system gennem genetiske modifikationer kombineret med vores viden om 3D-strukturen muliggjorde bestemmelsen af konformationen af signalsekvensen og det tidlige modne område umiddelbart før indsættelse i kanal 3.

FRET involverer strålingsfri overførsel af energi fra et molekyle (donor) til et andet (acceptor) på en afstandsafhængig måde, der er gennem rum 4,5. Effektiviteten af denne overførsel overvåges gennem enten et fald i donor eller en stigning i acceptorfluorescensintensitet. Effektiviteten af energioverførsel kan beskrives som

E = R06/(R06 + R6)

hvor R0-værdien er den afstand, hvor overførslen er 50% effektiv6. Teknikken er tidligere blevet beskrevet som en molekylær lineal og er effektiv til at bestemme afstande i området 2,5-12 nm, afhængigt af identiteten af donoracceptorfarvestofferne 4,7,8,9. Donorfluorescensensensiteterne og levetiderne med eller uden acceptor gør det muligt at bestemme overførselseffektiviteten og dermed afstande 5,8. På grund af teknologiens tilgængelighed, metodens følsomhed og brugervenlighed har FRET også fundet bred anvendelse på områder som enkeltmolekyle fluorescensspektroskopi og konfokal mikroskopi6. Fremkomsten af fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein har gjort observationen af intracellulær dynamik og levende celledannelse relativt letkøbt10,11. Mange FRET-applikationer som disse diskuteres detaljeret i dette virtuelle nummer.

I denne undersøgelse fokuserer vi især på brugen af FRET-målinger til at give afstandsværdier til bestemmelse af strukturelle detaljer. Tidligere er FRET-målinger blevet anvendt effektivt til at bestemme konformationen af DNA-molekyler, når de er bundet til protein 12,13,14, proteiners indre dynamik og proteinbindingsinteraktioner 15,16,17. Fordelene ved denne metode ligger i evnen til at bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mængder materiale. Det er vigtigt, at denne metode er særlig effektiv, når den anvendes sammen med eksisterende strukturelle oplysninger og ikke kan bruges som et middel til bestemmelse af 3D-struktur. Metoden giver den bedste indsigt og forfinelse af struktur, hvis arbejdet bygger på eksisterende strukturelle oplysninger ofte kombineret med beregningssimulering18,19. Her beskrives brugen af afstande opnået fra steady-state og tidsopløste FRET-målinger til at kortlægge et bindingssted, hvis placering ikke var kendt, på en eksisterende krystallografisk struktur af SecA-SecYEG-komplekset, større proteiner i den generelle sekretoriske vej3.

Den generelle sekretoriske vej, et stærkt bevaret system fra prokaryoter til eukaryoter til arkæer, formidler transporten af proteiner enten over eller ind i membranen til deres funktionelle placering i cellen. For gramnegative bakterier, såsom E. coli, den organisme, der anvendes i vores undersøgelse, indsættes proteiner i eller translokeres over den indre membran til periplasmen. Det bakterielle SecY-kanalkompleks (kaldet translocon) koordinerer med andre proteiner for at translokere det nyligt syntetiserede protein, som er rettet mod dets korrekte placering i cellen gennem en signalsekvens, der typisk er placeret ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasmen associeres ATPase SecA-proteinet med ribosomets udgangstunnel og med præproteinet, efter at ca. 100 rester er blevet oversat22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opretholder det præproteinet i en udfoldet tilstand. SecA binder sig til SecYEG-translocon og letter gennem mange cyklusser af ATP-hydrolyse proteintransport over membranen23,24.

SecA er et multidomæneprotein, der findes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimerisk protein i cytosolen, SecA består af et præproteinbindende eller tværbindende domæne25, to nukleotidbindende domæner, et spiralformet vingedomæne, et spiralformet stilladsdomæne og to helixfinger (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske undersøgelser af SecA-SecYEG-komplekset antydede placeringen af THF, at det var aktivt involveret i proteintranslokation, og efterfølgende tværbindingseksperimenter med signalpeptidet fastslog yderligere betydningen af denne region i proteintranslokation30,31. Tidligere undersøgelser ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden viste, at eksogene signalpeptider binder til denne region af SecA 2,32. For fuldt ud at forstå konformationen og placeringen af signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet inden indsættelse i SecYEG-kanalen blev der oprettet en proteinkimera, hvor signalsekvensen og resterne fra det tidlige modne område blev fastgjort til SecA gennem en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjælp af denne biologisk levedygtige konstruktion blev det yderligere demonstreret, at signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet binder til THF på en parallel måde2. Efterfølgende blev FRET-kortlægningsmetoden brugt til at belyse konformationen og placeringen af signalsekvensen og det tidlige modne område i nærværelse af SecYEG som beskrevet nedenfor3.

Kendskab til 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige placering af bindingsstedet gjorde det muligt for os med omtanke at placere donor-acceptor-etiketter på steder, hvor skæringspunktet mellem individuelle FRET-afstande identificerer bindingsstedets placering. Disse FRET-kortlægningsmålinger afslørede, at signalsekvensen og det tidlige modne område af præproteinet danner en hårnål med spidsen placeret ved mundingen af SecYEG-kanalen, hvilket viser, at hårnålstrukturen er skabeloniseret før kanalindsættelse.

Protocol

1. Udvælgelse af mærkningssteder Identificer mindst tre potentielle mærkningssteder for at triangulere det formodede bindingssted på de eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfælde blev SecA, SecYEG og preprotein knyttet til SecA gennem genetisk fusion identificeret2. Vælg mærkningssteder inden for 25-75 Å fra det formodede bindingssted, og i relativt statiske områder af proteinet bestemmer afstanden det specifikke FRET-farvestofpar, der skal bruges<…

Representative Results

Denne undersøgelse fokuserede på at bestemme placeringen af præproteinbindingsstedet på SecA inden indsættelse af præproteinet i SecYEG-kanalen. For at kortlægge bindingsstedet blev FRET-eksperimenter udført mellem forskellige regioner af præproteinet og tre forskellige steder på SecA- og SecYEG-proteinerne (figur 1A-D). Fra de opnåede afstande og tredimensionelle strukturer af SecA, SecYEG og preproteinet blev placeringen af præproteinbindingsst…

Discussion

Ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden identificerede vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af en 3-D krystalstruktur af komplekset i høj grad lettede vores undersøgelse. Styrken ved denne kortlægningsmetode ligger i evnen til at bruge en eksisterende struktur til at identificere steder til mærkning. Denne metode kan ikke bruges til at bestemme en 3D-struktur; bestemmelse af strukturelle elementer56, forfining af en eksisterende struktur<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
  44. Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
  45. Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text: FRET MappingLigand Binding SitesSubunit OrientationConformational ChangesDynamic MotionsBiomolecular SystemLabeling SitesR0 ValuesDonor DyeAcceptor DyeSpectrofluorometerEmission ScanExcitation Wavelength
check_url/63433?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image