फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण मानचित्रण: वैश्विक संरचनात्मक विशेषताओं को स्पष्ट करने के लिए एक नई पद्धति
Summary
अध्ययन में लेबलिंग साइटों के चयन, रंगों की पसंद, अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण सहित एफआरईटी मैपिंग की पद्धति का विवरण दिया गया है। यह पद्धति प्रोटीन प्रणालियों में बाध्यकारी साइटों, रचनात्मक परिवर्तनों और गतिशील गतियों को निर्धारित करने में प्रभावी है और मौजूदा 3-डी संरचनात्मक जानकारी के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन करने पर सबसे उपयोगी है।
Abstract
फोरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) एक स्थापित प्रतिदीप्ति-आधारित विधि है जिसका उपयोग इन विट्रो में और साथ ही कोशिकाओं के भीतर बायोमोलेक्यूल्स के बीच की दूरी को सफलतापूर्वक मापने के लिए किया जाता है। एफआरईटी में, प्रतिदीप्ति तीव्रता या जीवनकाल में परिवर्तन से मापा गया ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता, दो फ्लोरोसेंट अणुओं या लेबल के बीच की दूरी से संबंधित है। दूरी से गतिशीलता और रचनात्मक परिवर्तनों का निर्धारण जैविक प्रणालियों के लिए इस पद्धति के अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण हैं। कुछ शर्तों के तहत, यह पद्धति गतिशीलता, लचीलापन और बाध्यकारी सतहों के अनुकूलन के बारे में जानकारी प्रदान करके मौजूदा एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं को जोड़ और बढ़ा सकती है। हम एक बाध्यकारी साइट की पहचान या डिमर सबयूनिट्स के झुकाव के माध्यम से संरचनात्मक गुणों को स्पष्ट करने के लिए एफआरईटी और संबंधित दूरी निर्धारण के उपयोग का वर्णन करते हैं। लेबलिंग साइटों की विवेकपूर्ण पसंद के माध्यम से, और अक्सर कई लेबलिंग रणनीतियों के रोजगार के माध्यम से, हमने प्रोटीन-डीएनए कॉम्प्लेक्स और एसईसीए-एसईसीवाईईजी प्रोटीन ट्रांसलोकेशन सिस्टम में वैश्विक संरचनात्मक गुणों को निर्धारित करने के लिए इन मानचित्रण विधियों को सफलतापूर्वक लागू किया है। एसईसीए-सेकिएग प्रणाली में, हमने प्रीप्रोटीन-बाइंडिंग साइट की पहचान करने और बाध्य सिग्नल अनुक्रम क्षेत्र के स्थानीय विरूपण को निर्धारित करने के लिए एफआरईटी मैपिंग विधियों का उपयोग किया है। यह अध्ययन उचित लेबलिंग साइटों की पहचान, गैर-देशी अमीनो एसिड अवशेषों सहित संभावित लेबल की चर्चा, लेबलिंग प्रक्रियाओं, माप कैसे करें, और डेटा की व्याख्या सहित एफआरईटी मैपिंग अध्ययन करने के चरणों की रूपरेखा तैयार करता है।
Introduction
प्रोटीन के लिए, 3-आयामी (3-डी) संरचनात्मक ज्ञान के साथ गतिशीलता की व्याख्या जैव-आणविक प्रणालियों के संरचना-कार्य संबंधों की बढ़ी हुई समझ की ओर ले जाती है। संरचनात्मक तरीके, जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एक स्थिर संरचना पर कब्जा करते हैं और अक्सर बायोमोलेक्यूल बाइंडिंग और गतिशीलता के पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए कई संरचनाओं के निर्धारण की आवश्यकता होती है1. यह आलेख वैश्विक संरचनात्मक तत्वों, जैसे बाध्यकारी साइटों या बाइंडिंग इंटरैक्शन को मैप करने के लिए समाधान-आधारित विधि पर चर्चा करता है, जो संभावित रूप से अधिक क्षणिक हैं और स्थिर विधियों द्वारा कम आसानी से कैप्चर किए जाते हैं। इस पद्धति के लिए मजबूत उम्मीदवार सिस्टम वे हैं जिनमें एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी या अन्य संरचनात्मक तरीकों द्वारा पहले 3-डी संरचना निर्धारित की गई है। इस मामले में, हम झिल्ली2 में प्रीप्रोटीन के परिवहन से पहले फोरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) का उपयोग करके सिग्नल पेप्टाइड बाइंडिंग साइट के स्थान को मैप करने के लिए प्रोटीन सामान्य स्रावी मार्ग में एक केंद्रीय खिलाड़ी, एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का लाभ उठाते हैं। 3-डी संरचना के हमारे ज्ञान के साथ युग्मित आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से जैविक प्रणाली के हेरफेर ने चैनल 3 में सम्मिलन से तुरंत पहले सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के विरूपण के निर्धारण को सक्षम किया।
एफआरईटी में एक अणु (दाता) से दूसरे (स्वीकर्ता) तक ऊर्जा का विकिरण-कम हस्तांतरण एक दूरी-निर्भर फैशन में शामिल है जो अंतरिक्ष 4,5 के माध्यम से है। दाता में कमी या स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के माध्यम से इस हस्तांतरण की दक्षता की निगरानी की जाती है। ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता के रूप में वर्णित किया जा सकता है
ई = आर06/(आर06 + आर6)
जिसमें आर0 मान वह दूरी है जिस पर स्थानांतरण 50% कुशलहै 6. तकनीक को पहले एक आणविक शासक के रूप में वर्णित किया गया है और दाता-स्वीकर्ता रंगों 4,7,8,9 की पहचान के आधार पर 2.5-12 एनएम रेंज में दूरी निर्धारित करने में प्रभावी है। दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्वीकर्ता के साथ या उसके बिना जीवनकाल हस्तांतरण क्षमता के निर्धारण की अनुमति देते हैं और परिणामस्वरूप, दूरी 5,8। प्रौद्योगिकी की उपलब्धता, विधि की संवेदनशीलता और उपयोग में आसानी के कारण, एफआरईटी ने एकल-अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी6 जैसे क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग भी पाया है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आगमन ने इंट्रासेल्युलर गतिशीलता और लाइव-सेल इमेजिंग के अवलोकन को अपेक्षाकृत आसान10,11 बना दिया है। इस आभासी मुद्दे में इस तरह के कई FRET अनुप्रयोगों पर विस्तार से चर्चा की जाती है।
इस अध्ययन में, हम विशेष रूप से संरचनात्मक विवरण निर्धारित करने के लिए दूरी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए एफआरईटी माप के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इससे पहले, एफआरईटी माप का उपयोग डीएनए अणुओं के विरूपण को निर्धारित करने के लिए प्रभावी ढंग से किया गया है जब प्रोटीन 12,13,14, प्रोटीन की आंतरिक गतिशीलता और प्रोटीन बाध्यकारी बातचीत 15,16,17 से बंधे होते हैं। इस पद्धति के फायदे अपेक्षाकृत कम मात्रा में सामग्री के साथ समाधान में लचीले और गतिशील संरचनात्मक तत्वों को निर्धारित करने की क्षमता में निहित हैं। गौरतलब है कि यह विधि विशेष रूप से प्रभावी है जब मौजूदा संरचनात्मक जानकारी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग 3-डी संरचना निर्धारण के साधन के रूप में नहीं किया जा सकता है। विधि संरचना की सर्वोत्तम अंतर्दृष्टि और शोधन प्रदान करती है यदि काम मौजूदा संरचनात्मक जानकारी पर बनाता है जो अक्सर कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन18,19 के साथ युग्मित होता है। यहां, स्थिर-अवस्था और समय-हल किए गए एफआरईटी माप से प्राप्त दूरी का उपयोग एक बाध्यकारी साइट को मैप करने के लिए वर्णित किया गया है, जिसका स्थान ज्ञात नहीं था, एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स की मौजूदा क्रिस्टलोग्राफिक संरचना पर, सामान्य स्रावी मार्ग में प्रमुख प्रोटीन3.
सामान्य स्रावी मार्ग, प्रोकैरियोट्स से यूकेरियोट्स से आर्किया तक एक अत्यधिक संरक्षित प्रणाली, कोशिका में उनके कार्यात्मक स्थान पर झिल्ली के पार या अंदर प्रोटीन के परिवहन की मध्यस्थता करती है। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए, जैसे कि ई कोलाई, हमारे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जीव, प्रोटीन को आंतरिक झिल्ली में डाला जाता है या पेरिप्लाज्म में स्थानांतरित किया जाता है। बैक्टीरियल SecY चैनल कॉम्प्लेक्स (जिसे ट्रांसलोकॉन कहा जाता है) नए संश्लेषित प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए अन्य प्रोटीनों के साथ समन्वय करता है, जिसे आमतौर पर एन-टर्मिनस20,21 में स्थित सिग्नल अनुक्रम के माध्यम से सेल में अपने सही स्थान पर निर्देशित किया जाता है। पेरिप्लाज्म के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए, एटीपीस एसईसीए प्रोटीन राइबोसोम की निकास सुरंग के साथ जुड़ता है, और लगभग 100 अवशेषों के बाद प्रीप्रोटीन के साथ22 का अनुवाद किया गया है। एसईसीबी चैपरोन प्रोटीन के साथ, यह प्रीप्रोटीन को एक खुली अवस्था में बनाए रखता है। एसईसीए एसईसीवाईईजी ट्रांसलोकन को बांधता है, और एटीपी हाइड्रोलिसिस के कई चक्रों के माध्यम से, झिल्ली23,24 में प्रोटीन परिवहन की सुविधा प्रदान करता है।
एसईसीए एक बहु-डोमेन प्रोटीन है जो साइटोसोलिक और झिल्ली-बाध्य रूपों में मौजूद है। साइटोसोल में एक होमोडिमेरिक प्रोटीन, एसईसीए में एक प्रीप्रोटीन बाइंडिंग या क्रॉस-लिंकिंग डोमेन25, दो न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग डोमेन, एक पेचदार विंग डोमेन, एक पेचदार मचान डोमेन और दो हेलिक्स फिंगर (टीएचएफ) 26,27,28,29 (चित्रा 1) होते हैं। एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स के पिछले क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययनों में, टीएचएफ के स्थान ने सुझाव दिया कि यह प्रोटीन अनुवाद में सक्रिय रूप से शामिल था और सिग्नल पेप्टाइड के साथ बाद के क्रॉस-लिंकिंग प्रयोगों ने प्रोटीन ट्रांसलोकेशन30,31 में इस क्षेत्र के महत्व को और स्थापित किया। पिछले अध्ययनों ने एफआरईटी मैपिंग पद्धति का उपयोग करते हुए दिखाया कि बहिर्जात सिग्नल पेप्टाइड्स एसईसीए2,32 के इस क्षेत्र से बंधते हैं। SecYEG चैनल में सम्मिलन से पहले सिग्नल अनुक्रम और प्रीप्रोटीन के शुरुआती परिपक्व क्षेत्र के विरूपण और स्थान को पूरी तरह से समझने के लिए, एक प्रोटीन चिमेरा जिसमें प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के सिग्नल अनुक्रम और अवशेष एक सेर-ग्ली लिंकर के माध्यम से एसईसीए से जुड़े थे (चित्रा 1)। इस जैविक रूप से व्यवहार्य निर्माण का उपयोग करते हुए, यह आगे प्रदर्शित किया गया था कि प्रीप्रोटीन का सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र समानांतर फैशन2 में टीएचएफ से बंधता है। इसके बाद, एफआरईटी मैपिंग पद्धति का उपयोग सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के विरूपण और स्थान को स्पष्ट करने के लिए किया गया था, जैसाकि नीचे वर्णित है।
एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स33,34,35 की 3-डी संरचना का ज्ञान और बाध्यकारी साइट के संभावित स्थान ने हमें उन स्थानों पर दाता-स्वीकर्ता लेबल को विवेकपूर्ण ढंग से रखने की अनुमति दी जहां व्यक्तिगत एफआरईटी दूरी का चौराहा बाध्यकारी साइट स्थान की पहचान करता है। इन एफआरईटी मैपिंग मापों से पता चला है कि सिग्नल अनुक्रम और प्रीप्रोटीन का प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र SecYEG चैनल के मुंह पर स्थित टिप के साथ एक हेयरपिन बनाता है, यह दर्शाता है कि चैनल सम्मिलन से पहले हेयरपिन संरचना टेम्पलेट की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एफआरईटी मैपिंग पद्धति के उपयोग के माध्यम से, हमने एसईसीए प्रोटीन पर सिग्नल अनुक्रम बाध्यकारी साइट की पहचान की। महत्वपूर्ण बात यह है कि परिसर की 3-डी क्रिस्टल संरचना की उपस्थिति ने हमारे अध्ययन को बहुत ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर 15 जीएम 135904 (आईएम को सम्मानित) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट जीएम 110552 (डीबीओ को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
| Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
| H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
| PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
| Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
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