वर्तमान प्रोटोकॉल culturing, संग्रह, और Ditylenchus dipsaci स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय और सरल विधि का वर्णन करता है।
प्लांट-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) हर साल वैश्विक खाद्य फसलों के 12% से अधिक को नष्ट कर देते हैं, जो सालाना लगभग 157 बिलियन डॉलर (USD) के बराबर है। बढ़ती वैश्विक आबादी और सीमित कृषि योग्य भूमि के साथ, पीपीएन संक्रमण को नियंत्रित करना खाद्य उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। फसल की पैदावार को अधिकतम करने की चुनौती को जटिल करना नेमाटोड चयनात्मकता की कमी के कारण प्रभावी कीटनाशकों पर बढ़ते प्रतिबंध हैं। इसलिए, खाद्य सुरक्षा के लिए नए और सुरक्षित रासायनिक नेमेटिकाइड्स विकसित करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, पीपीएन प्रजातियों की संस्कृति और संग्रह Ditylenchus dipsaci का प्रदर्शन किया जाता है। D. dipsaci दोनों आर्थिक रूप से हानिकारक है और अधिकांश आधुनिक nematicides के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी है। वर्तमान काम यह भी बताता है कि उपन्यास छोटे अणु नेमेटिकाइड्स के लिए स्क्रीन में इन नेमाटोड का उपयोग कैसे किया जाए और डेटा संग्रह और विश्लेषण के तरीकों पर रिपोर्ट की जाए। प्रदर्शित पाइपलाइन प्रति सप्ताह हजारों यौगिकों का थ्रूपुट प्रदान करती है और इसे अन्य पीपीएन प्रजातियों जैसे कि प्रैटिलेंकस पेनेट्रांस के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग नए नेमेटिकाइड्स की खोज के लिए किया जा सकता है, जो बदले में, अत्यधिक चयनात्मक वाणिज्यिक उत्पादों में विकसित हो सकते हैं जो तेजी से भूखी दुनिया को खिलाने में मदद करने के लिए पीपीएन का सुरक्षित रूप से मुकाबला करते हैं।
संयंत्र-परजीवी नेमाटोड (पीपीएन) वैश्विक खाद्य उत्पादन के 12.3% के नुकसान के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान है और सालाना 1,2,3 को अनुमानित157 बिलियन डॉलर की क्षति का कारण बनता है। दुर्भाग्य से, पीपीएन को नियंत्रित करने की क्षमता कम हो रही है क्योंकि प्रभावी रासायनिक नेमेटिकाइड्स पर प्रतिबंध लगा दिया गया है या मानव सुरक्षा और पर्यावरणीय चिंताओं के कारण बढ़ते प्रतिबंधों का सामना करना पड़ रहा है। यह मुख्य रूप से कीटनाशकों की पिछली पीढ़ियों की खराब सूत्रकृमि चयनात्मकता के कारणहै। पिछले 25 वर्षों में, छह नए रासायनिक नेमेटिकाइड्स को पायलट किया गया है या बाजार में पेश किया गयाहै। इनमें से एक को पहले ही यूरोप में प्रतिबंधित कर दिया गया है, और दूसरे को बंद कर दिया गया है, जबकि मानव हीटल 6,7 पर इसके प्रभाव के लिए जांच की जा रही है। इसलिए, नए नेमैटिकाइड्स की आवश्यकता है जो पीपीएन के लिए अत्यधिक चयनात्मक हैं।
स्टेम और बल्ब नेमाटोड, डिटिलेंकस डिप्सासी (डी. डिप्सासी) एक आर्थिक रूप से प्रभावशाली PPN4 है। D. dipsaci 30 जैविक दौड़ में लगभग 500 पौधों की प्रजातियों को संक्रमित करता है और राई, जई, लहसुन, प्याज और लीक 8,9 जैसी कुछ सबसे कृषि रूप से महत्वपूर्ण फसलों को लक्षित करता है। उदाहरण के लिए, डी डिप्सासी ने हाल ही में ओंटारियो और क्यूबेक में लहसुन के खेतों को बंद कर दिया है, जिसके परिणामस्वरूप 90% 10,11 तक का नुकसान हुआ है। इसका भौगोलिक वितरण लगभग सर्वव्यापी है और इसमें अमेरिका (कैलिफोर्निया और फ्लोरिडा सहित), यूरोप, एशिया का अधिकांश हिस्सा (चीन सहित) और ओशिनिया9 शामिल हैं। डिप्सासी एक प्रवासी एंडोपैरासाइट है जो पत्तियों या घावों और लैंटिसल्स पर स्टोमेटा में प्रवेश करता है जहां वे सेल की दीवार को तोड़ने के लिए एंजाइम जारी करते हैं। फसलों पर डी डिप्सासी के प्रभाव को जोड़ते हुए, पीपीएन के कारण होने वाली क्षति पौधे को द्वितीयक संक्रमणके लिए अतिसंवेदनशील बनाती है। दुर्भाग्य से, डी डिप्सासी अन्य नेमाटोड उपभेदों13,14 की तुलना में वर्तमान नेमेटिकाइड्स के लिए उच्च सहिष्णुता के स्तर को दिखाता है।
यह प्रोटोकॉल D. dipsaci की खेती का वर्णन करता है, और छोटे अणु उम्मीदवार nematicides के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन में इसके उपयोग का वर्णन करता है। संक्षेप में, डी डिप्सासी आबादी को बनाए रखा जाता है और बाँझ गैम्बोर्ग बी -5 (जीए) मीडिया15 में सुसंस्कृत मटर के पौधों पर विस्तारित किया जाता है। जीए माध्यम पर बीज स्प्राउट्स उगाने से पहले, बीजों को धोने की एक श्रृंखला के माध्यम से निष्फल किया जाना चाहिए और संदूषण की जांच करने के लिए पोषक तत्व आगर (एनए) पर मढ़वाया जाना चाहिए। बीज नसबंदी बैक्टीरिया और कवक संदूषकों का पता लगाने के लिए आवश्यक है जो मौजूद हो सकते हैं। गैर-दूषित बीजों को तब जीए प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जहां बीज स्प्राउट्स संक्रमण की तैयारी में बढ़ेंगे। बीज स्प्राउट्स युक्त जीए प्लेटों को ताजा प्लेटों में जड़ ऊतक वाले आगर के एक टुकड़े को स्थानांतरित करके पिछली संस्कृति प्लेट से नेमाटोड से संक्रमित किया जाता है। 6-8 सप्ताह के बाद, नेमाटोड को जीए मीडिया से निकाला जाता है और एक कॉफी फिल्टर-पंक्तिबद्ध फ़नल के माध्यम से संग्रह बीकर में फ़िल्टर किया जाता है। एक बार एक उपयुक्त संख्या एकत्र किए जाने के बाद नेमाटोड का उपयोग विभिन्न बायोएसेस में किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक प्रति संस्कृति प्लेट लगभग 15,000 डी डिप्सासी उत्पन्न करती है। D. dipsaci की खेती करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल16,17 प्रकाशित किए गए हैं।
पिछले काम18 के आधार पर एक इन विट्रो छोटे अणु स्क्रीनिंग परख में भी यहाँ वर्णित है. कृमि स्वास्थ्य के एक प्रॉक्सी के रूप में, प्रति अच्छी तरह से 20 नेमाटोड की गतिशीलता की जांच छोटे अणु जोखिम के 5 दिनों के बाद की जाती है। बेहतर कीड़ा गतिशीलता की कल्पना करने के लिए, NaOH को जीवित कीड़े19,20 के आंदोलन को बढ़ाने के लिए जोड़ा जाता है। यह प्रोटोकॉल मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति देता है और छोटे अणुओं की नेमैटिकाइडल क्षमता का आकलन करने के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करता है। यदि एक अलग सूत्रकृमि संग्रह तकनीक का उपयोग16,17 किया जाता है, तो यहां वर्णित छोटे अणु स्क्रीनिंग पद्धति को फिर भी लागू किया जा सकता है।
महत्वपूर्ण कदम
प्रोटोकॉल की सादगी के बावजूद, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं जो सफलता की संभावना को अधिकतम करने के लिए अतिरिक्त ध्यान देने योग्य हैं। सबसे पहले, बीजों को ओवरब्लीचिंग उनके विकास को बाधित कर सकता है। इसलिए, ब्लीचिंग समाधान में बीज के समय को 20 मिनट या उससे कम तक सीमित करना आवश्यक है। दूसरा, जैसा कि पहले स्टोरली एट अल द्वारा उल्लेख किया गया था, नेमाटोड का स्पष्ट स्वास्थ्य 4 डिग्री सेल्सियस16 पर संग्रहीत होने पर समय के साथ कम हो जाता है। उनके संग्रह के तुरंत बाद नेमाटोड का उपयोग करने से अतिरिक्त आत्मविश्वास मिलता है कि इष्टतम स्क्रीनिंग की स्थिति प्राप्त की जा सकती है। क्या दीर्घकालिक भंडारण आवश्यक होना चाहिए, सुनिश्चित करें कि ट्यूब का ढक्कन ऑक्सीजन एक्सचेंज की अनुमति देने के लिए तंग नहीं है। तीसरा, यह सुनिश्चित करना कि मटर सुझाए गए समय के लिए एनए प्लेटों पर बढ़ता है, प्रयोगकर्ता को यह तय करने में सक्षम बनाता है कि कौन से बीज दूषित हैं। चौथा, नेमाटोड जोड़ने से पहले जीए प्लेटों पर मटर को ओवरग्रो करने से संक्रमण कमजोर हो जाएगा और नेमाटोड की उपज कम हो जाएगी। अंत में, कई कारक जिन्हें नियंत्रित करना मुश्किल है, वे स्क्रीनिंग परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, परिणामों की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न दिनों में और आदर्श रूप से विभिन्न संस्कृति प्लेटों से एकत्र किए गए पीपीएन के साथ कई स्वतंत्र प्रतिकृति स्क्रीन करना आवश्यक है।
विधि की सीमाएँ
प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह एकत्र किए गए कीड़े के विकास के चरण को सिंक्रनाइज़ करने में विफल रहता है, जो किशोरों से लेकर वयस्कों तक होता है। इसलिए, किसी भी स्क्रीन द्वारा प्रकट किए गए मजबूत हिट कई चरणों में प्रभावी होने की संभावना है। हालांकि, प्रोटोकॉल प्रभावी चरण-विशिष्ट हिट को अनदेखा करने के जोखिम को बढ़ाता है। एक दूसरा विचार यह है कि इन विट्रो स्क्रीनिंग को नेमाटाइसाइड-डिस्कवरी पाइपलाइन में पहला कदम माना जाना चाहिए; मिट्टी आधारित assays हिट की translatability का परीक्षण करने के लिए एक पाइपलाइन के लिए एक उत्कृष्ट इसके अलावा कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल का महत्व और अनुप्रयोग
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सरल और आसानी से दोहराए जाते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को प्रयोगशाला में अन्य पीपीएन पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जिसमें केवल मामूली संशोधन करके प्रैटिलेंकस पेनेट्रांस भी शामिल हैं। वैश्विक खाद्य सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए नए और सुरक्षित पीपीएन नियंत्रण उपायों का विकास करना आवश्यक है। यह विशेष रूप से डी डिप्सासी जैसी प्रजातियों के लिए सच है जो आमतौर पर वर्तमान में स्वीकार्य रासायनिक नेमेटिकाइड्स13,14 की एक विस्तृत विविधता के प्रति सहिष्णु होते हैं। इसलिए, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में वैश्विक स्तर पर मानव स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण योगदान देने की क्षमता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ किंग यू (कृषि और कृषि-खाद्य कनाडा) को Ditylenchus dipsaci संस्कृति प्रदान करने और संस्कृति विधियों पर सलाह के लिए स्वीकार करते हैं; डॉ बेंजामिन Mimee (कृषि और कृषि खाद्य कनाडा) और Nathalie Dauphinais (कृषि और कृषि खाद्य कनाडा) संयंत्र परजीवी नेमाटोड के इन विट्रो संस्कृति पर सलाह के लिए; परियोजना और पांडुलिपि पर उपयोगी सुझावों के लिए डॉ एंड्रयू बर्न्स और शॉन हैरिंगटन। JK एक NSERC अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलर है। PJR एक CIHR परियोजना अनुदान (313296) द्वारा समर्थित है। PJR रासायनिक आनुवंशिकी में एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी (टियर 1) है।
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
2 forceps | Almedic | 7747-A10-108 | |
2L beaker | Pyrex | CLS10002L | |
50mL beaker | Pyrex | CLS100050 | |
96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
aluminium foil | Alcan Plus | ||
bacteriological agar | BioShop | AGR001.5 | |
coffee filter | No name brand | 716 | |
commercial bleach 6% | Lavo Pro 6 | DIN102358107 | |
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) | Fisherbrand | FB0875712 | |
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) | Sigma-Aldrich | Z358762 | |
dissecting scope | Leica | Leica MZ75 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | |
Funnel | VWR | 414004-270 | |
Gamborg B5 | Sigma-Aldrich | G5893-10L | |
glass petri dish | VWR | 75845-546 | |
glass slide | MAGNA | 60-1200 | |
Lint-Free Blotting Paper | V&P Scientific | VP 522-100 | |
mutlichannel pipette | Eppendorf research plus | 3125000036 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
nutrient agar | Sigma-Aldrich | 70148-100G | |
parafilm | Bemis | PM-996 | |
pea seeds | Ontario Seed Company | D-1995-250G | |
pin cleaning solutions | V&P Scientific | VP110A | |
pinner | V&P Scientific | VP381N | |
pinner rinse trays | V&P Scientific | VP 421 | |
pipette tips- low retention ? Reg. 200uL | LABFORCE | 1159M44 | |
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes | Sigma-Aldrich | BR703459 | |
shaking incubator | New Brunswick Scientific | I26 | |
sterile surgical blade | MAGNA | sb21-100-a | |
stir bar | Fisherbrand | 2109 – 1451359 | |
sucrose | BioShop | SUC507.1 |