Den nuværende protokol beskriver en pålidelig og ligetil metode til dyrkning, indsamling og screening af Ditylenchus dipsaci.
Planteparasitære nematoder (PPN’er) ødelægger over 12% af de globale fødevareafgrøder hvert år, hvilket svarer til ca. 157 milliarder dollars (USD) tabt årligt. Med en voksende global befolkning og begrænset agerjord er kontrol med PPN-angreb afgørende for fødevareproduktionen. Udfordringen med at maksimere afgrødeudbyttet forværres af de stigende begrænsninger for effektive pesticider på grund af manglende nematodeseleivitet. Derfor er udvikling af nye og sikre kemiske nematicider afgørende for fødevaresikkerheden. I denne protokol demonstreres kulturen og samlingen af PPN-arten Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci er både økonomisk skadelig og relativt modstandsdygtig over for de fleste moderne nematicider. Det nuværende arbejde forklarer også, hvordan man bruger disse nematoder i skærme til nye små molekylenematicider og rapporter om dataindsamlings- og analysemetoder. Den demonstrerede rørledning giver en gennemstrømning på tusindvis af forbindelser om ugen og kan let tilpasses til brug med andre PPN-arter såsom Pratylenchus penetrans. De teknikker, der er beskrevet heri, kan bruges til at opdage nye nematicider, som igen kan videreudvikles til meget selektive kommercielle produkter, der sikkert bekæmper PPN’er for at hjælpe med at fodre en stadig mere sulten verden.
Planteparasitære nematoder (PPN’er) anslås at være ansvarlige for tabet af 12,3% af den globale fødevareproduktion og forårsage anslået 157 milliarder dollars i skade årligt 1,2,3. Desværre er evnen til at kontrollere PPN’er aftagende, fordi effektive kemiske nematicider er blevet forbudt eller står over for eskalerende restriktioner på grund af menneskers sikkerhed og miljøhensyn. Dette skyldes primært den dårlige nematodesseleticitet hos tidligere generationer af pesticider4. I løbet af de sidste 25 år er seks nye kemiske nematicider blevet afprøvet eller introduceret på markedet5. En af disse er allerede blevet forbudt i Europa, og en anden er blevet afbrudt, mens den undersøges for dens indvirkning på menneskeligvarmelh 6,7. Der er derfor et presserende behov for nye nematicider, der er meget selektive for PPN’er.
Stamme- og pærenematoden, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) er en økonomisk virkningsfuld PPN4. D. dipsaci inficerer næsten 500 plantearter på tværs af 30 biologiske racer og er målrettet mod nogle af de mest landbrugsmæssigt vigtige afgrøder som rug, havre, hvidløg, løg og porre 8,9. For eksempel har D. dipsaci for nylig pisket hvidløgsmarker i Ontario og Quebec, hvilket resulterer i tab på op til 90%10,11. Dens geografiske fordeling er næsten allestedsnærværende og omfatter Amerika (herunder Californien og Florida), Europa, meget af Asien (herunder Kina) og Oceanien9. D. dipsaci er en migrerende endoparasit, der kommer ind i stomata på blade eller sår og lenticeller, hvor de frigiver enzymer for at nedbryde cellevæggen12. Ved at forværre virkningen af D. dipsaci på afgrøder gør skaden forårsaget af PPN planten modtagelig for sekundær infektion11. Desværre viser D. dipsaci høje toleranceniveauer over for nuværende nematicider sammenlignet med andre nematodestammer13,14.
Denne protokol beskriver dyrkningen af D. dipsaci og dens anvendelse i store skærme til små molekylekandidatnematicider. Kort fortalt opretholdes og udvides D. dipsaci-populationerne på ærteplanter dyrket i sterile Gamborg B-5 (GA) medier15. Før der dyrkes frøspirer på GA-medium, skal frøene steriliseres gennem en række vaske og belægges på næringsstofagar (NA) for at kontrollere for forurening. Frøsterilisering er afgørende for at detektere bakterielle og svampeforurenende stoffer, der kan være til stede. De ikke-forurenede frø overføres derefter til GA-plader, hvor frøspirer vil vokse som forberedelse til infektion. GA-pladerne, der indeholder frøspirer, inficeres med nematoder fra en tidligere kulturplade ved at overføre et stykke agar indeholdende rodvæv til de friske plader. Efter 6-8 uger ekstraheres nematoderne fra GA-medierne og filtreres gennem en kaffefilterforet tragt til et opsamlingsbægerglas. Nematoderne kan anvendes i forskellige bioassays, når et passende antal er indsamlet. Teknikken beskrevet i denne protokol genererer ca. 15.000 D. dipsaci pr. Kulturplade. Alternative protokoller til dyrkning af D. dipsaci er blevet offentliggjort16,17.
Et in vitro screeningsassay for små molekyler baseret på tidligere arbejde18 er også beskrevet her. Som en proxy for ormens sundhed undersøges mobiliteten af 20 nematoder pr. Brønd efter 5 dages eksponering for små molekyler. For bedre at visualisere ormens mobilitet tilføjes NaOH for at øge bevægelsen af levende orme19,20. Denne protokol tillader screening af medium gennemstrømning og giver værdifulde data til vurdering af små molekylers nematiske potentiale. Hvis der anvendes en anden nematodeopsamlingsteknik16,17, kan den heri beskrevne screeningsmetode for små molekyler ikke desto mindre gennemføres.
Kritiske skridt
På trods af protokollens enkelhed er der kritiske trin i protokollen, der fortjener yderligere opmærksomhed for at maksimere sandsynligheden for succes. For det første kan overblening af frøene forstyrre deres vækst. Derfor er det vigtigt at begrænse frøenes tid i blegeopløsningen til 20 minutter eller mindre. For det andet, som tidligere bemærket af Storelli et al., falder nematodernes tilsyneladende sundhed over tid, når de opbevares ved 4 ° C16. Brug af nematoderne kort efter deres indsamling giver yderligere tillid til, at optimale screeningsbetingelser kan opnås. Hvis længerevarende opbevaring er nødvendig, skal du sørge for, at rørets låg ikke er stramt for at tillade iltudveksling. For det tredje kan forsøgspersonen ved at sikre, at ærterne vokser på NA-pladerne i den foreslåede tid, bedømme, hvilke frø der er forurenet. For det fjerde vil overgroning af ærterne på GA-pladerne, før nematoderne tilsættes, svække infektionen og reducere nematodeudbyttet. Endelig kan mange faktorer, der er vanskelige at kontrollere, påvirke screeningsresultaterne. Derfor er det vigtigt at udføre flere uafhængige replikatskærme på forskellige dage og ideelt set med PPN’er indsamlet fra forskellige kulturplader for at sikre reproducerbarheden af resultaterne.
Begrænsninger af metode
En begrænsning af protokollen er, at den ikke synkroniserer udviklingsstadiet for de indsamlede orme, der spænder fra unge til voksne. Derfor er stærke hits, der afsløres af enhver skærm, sandsynligvis effektive i flere faser. Protokollen øger dog risikoen for at overse effektive scenespecifikke hits. En anden overvejelse er, at in vitro-screening bør betragtes som det første skridt i en nematicid-opdagelsespipeline; jordbaserede assays er en glimrende tilføjelse til en pipeline for at teste oversættelsen af hits.
Protokollens betydning og anvendelse
De protokoller, der er beskrevet heri, er enkle og nemme at replikere. Desuden er denne protokol blevet anvendt med succes på andre PPN’er i laboratoriet, herunder Pratylenchus penetrans, ved kun at foretage små ændringer. Udvikling af nye og sikre PPN-kontrolforanstaltninger er afgørende for at sikre den globale fødevaresikkerhed. Dette gælder især for arter som D. dipsaci, der generelt er tolerante over for en lang række aktuelt acceptable kemiske nematicider13,14. De protokoller, der er skitseret her, har derfor potentiale til at yde et vigtigt bidrag til menneskers sundhed på globalt plan.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Dr. Qing Yu (Landbrug og Agri-Food Canada) for at levere Ditylenchus dipsaci-kulturen og for rådgivning om kulturmetoder; Dr. Benjamin Mimee (Landbrug og Agri-Food Canada) og Nathalie Dauphinais (Landbrug og Agri-Food Canada) for rådgivning om in vitro-kultur af planteparasitære nematoder; Dr. Andrew Burns og Sean Harrington for nyttige forslag til projektet og manuskriptet. JK er en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR er støttet af et CIHR-projekttilskud (313296). PJR er en Canada Research Chair (Tier 1) i kemisk genetik.
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
2 forceps | Almedic | 7747-A10-108 | |
2L beaker | Pyrex | CLS10002L | |
50mL beaker | Pyrex | CLS100050 | |
96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
aluminium foil | Alcan Plus | ||
bacteriological agar | BioShop | AGR001.5 | |
coffee filter | No name brand | 716 | |
commercial bleach 6% | Lavo Pro 6 | DIN102358107 | |
disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) | Fisherbrand | FB0875712 | |
disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) | Sigma-Aldrich | Z358762 | |
dissecting scope | Leica | Leica MZ75 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | |
Funnel | VWR | 414004-270 | |
Gamborg B5 | Sigma-Aldrich | G5893-10L | |
glass petri dish | VWR | 75845-546 | |
glass slide | MAGNA | 60-1200 | |
Lint-Free Blotting Paper | V&P Scientific | VP 522-100 | |
mutlichannel pipette | Eppendorf research plus | 3125000036 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
nutrient agar | Sigma-Aldrich | 70148-100G | |
parafilm | Bemis | PM-996 | |
pea seeds | Ontario Seed Company | D-1995-250G | |
pin cleaning solutions | V&P Scientific | VP110A | |
pinner | V&P Scientific | VP381N | |
pinner rinse trays | V&P Scientific | VP 421 | |
pipette tips- low retention ? Reg. 200uL | LABFORCE | 1159M44 | |
reagent reservoir with lid for multichannel pipettes | Sigma-Aldrich | BR703459 | |
shaking incubator | New Brunswick Scientific | I26 | |
sterile surgical blade | MAGNA | sb21-100-a | |
stir bar | Fisherbrand | 2109 – 1451359 | |
sucrose | BioShop | SUC507.1 |