Repeterende blodprøvetaking fra den subklaviske venen hos bevisst rotte
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for å samle blod fra vena subclavia hos rotter. Det muliggjør rask, rettidig og lett identifiserbar prøvetaking uten anestesi og oppnår blod av høy kvalitet gjennom repeterende prøveinnsamling.
Abstract
Rotter er mye brukt i farmakokinetikk (PK) og toksikokinetiske (TK) studier som trenger å samle en viss mengde blod på bestemte tidspunkter for å oppdage legemiddeleksponering. Prøvetakingsmetoden for rotteblod bestemmer plasmakvaliteten og påvirker presisjonen av testresultatene ytterligere. Den subklaviske veneblodinnsamlingsmetoden beskrevet i denne protokollen samler blodprøver gjentatte ganger i bevisst tilstand hos dyr for å møte behovene til PK- og TK-tester. Ferdighetene til fastholdelseshåndtering og passende prosedyre for nålsnitt sikrer suksessraten for blodinnsamling. Det er enkelt å betjene samtidig som det sikrer kvaliteten på plasma og samtidig ivaretar dyrevelferden. Imidlertid krever denne metoden dyktig drift, og en feil kan forårsake svakhet hos dyr, smerte, lameness og til og med dødelighet. Den nåværende metoden har blitt brukt i testanlegget for en 4-ukers oral toksisitetsstudie i Sprague Dawley (SD) rotter med TK. Maksimal mengde blod samlet innen 24 timer oversteg ikke 20% av dyrets totale blod. Dyrenes kroppsvekt var mer enn 200 g for menn og kvinner. Dataene viste at dyrenes kroppsvekt økte jevnt hver uke, og den kliniske observasjonen var normal etter repeterende prøvetaking.
Introduction
I henhold til International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidelines1 og National Medical Products Administration (NMPA) guidelines2, må antall blodinnsamlingstidspunkter for rotter i den toksikokinetiske (TK) studien oppfylle kravene i den dynamiske legemiddeleksponeringsvurderingen. Det omtrentlige totale blodvolumet til en rotte er 55-70 ml / kg kroppsvekt3. Innsamlingstidspunktene er generelt intensive innen 30 minutter etter dosering og reduseres etter det, og mer enn ti blodprøver må samles inn innen 48 timer i rutinemessig testing4. For eksempel samles blodprøver ved 12-tidspunkter (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 t, 2 t, 3 timer, 4 timer, 8 timer og 12 timer) i TK-studie av oralt administrerte legemidler. Forskere må gjentatte ganger samle 200-250 μL blod hos rotter for å oppnå høyverdig plasma for TK-testingen5.
Blodinnsamlingsstedene hos rotter inkluderer haleblodkar, retro-orbital plexusvene, submandibulær vene, hjerte, abdominal aorta6 og så videre. Blant dem er blodinnsamling fra rottens kaudale vene en ofte brukt metode, som krever erfarne og dyktige operatører 7,8. Å samle blod fra retro-orbital plexusvenen er mindre komplisert; Denne metoden anbefales imidlertid ikke, da den kan skade rottenes syn9, og blod fra hjertet og abdominalaorta er kun egnet for endelig blodprøvetaking10. En annen metode for å samle blod fra submandibulær vene i en bevisst rotte har vist seg å resultere i flere komplikasjoner og avslørt utilstrekkelig blodprøvekvalitet11. Derfor kan forskere bedøve dyret for å redusere vanskeligheten med prøvetaking. Likevel øker anestesien også kostnaden for forsøket, og mer alvorlig, det vil påvirke metabolsk tilstand av rotter12. Den nåværende protokollen bruker en rask og grei metode for å samle blod i de subklaviske venene hos rotter uten anestesi, noe som muliggjør nøyaktig posisjonering og bilateral vekslende blodinnsamling for å oppnå prøver av høy kvalitet på en rettidig og gjentatt måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er visse fordeler med å samle blod fra de subklaviske venene. (1) Siden stedet for blodsamlingen lett dissosieres, og den venøse plexus ikke er vanlig på grunn av rotternes forskjellige stillinger, kan den beskrevne metoden lett lokalisere posisjonen til venøs plexus samtidig som rotternes stabile og komfortable stillinger opprettholdes. (2) Operasjonen er enkel og gunstig for den raske utviklingen av teknikernes ferdigheter og mindre smerte for dyr. (3) En driftsmodus for å gjøre dyret komfortabelt reduserer r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) og Key Program “New Drug Creation” av Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B02020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 og No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
