Inokulationsstrategier til at inficere planterødder med jordbårne mikroorganismer
Summary
Denne protokol præsenterer et detaljeret resumé af strategier til podning af planterødder med jordbårne mikrober. Eksemplificeret for svampene Verticillium longisporum og Verticillium dahliae beskrives tre forskellige rodinfektionssystemer. Potentielle anvendelser og mulige downstream-analyser fremhæves, og fordele eller ulemper diskuteres for hvert system.
Abstract
Rhizosfæren har et meget komplekst mikrobielt samfund, hvor planterødder konstant udfordres. Rødder er i tæt kontakt med en lang række mikroorganismer, men undersøgelser af jordbårne interaktioner ligger stadig bag dem, der udføres på overjordiske organer. Selvom nogle podningsstrategier til infektion af modelplanter med modelrodpatogener er beskrevet i litteraturen, er det fortsat vanskeligt at få et omfattende metodologisk overblik. For at løse dette problem er tre forskellige rodpodningssystemer præcist beskrevet, der kan anvendes til at få indsigt i biologien af rod-mikrobeinteraktioner. Til illustration blev Verticillium-arter (nemlig V. longisporum og V. dahliae) anvendt som rodinvaderende modelpatogener. Metoderne kan dog let tilpasses andre rodkoloniserende mikrober – både patogene og gavnlige. Ved at kolonisere planten xylem udviser vaskulære jordbårne svampe som Verticillium spp. en unik livsstil. Efter rodinvasion spredes de via xylemkarrene akropetalt, når skuddet og fremkalder sygdomssymptomer. Tre repræsentative plantearter blev valgt som modelværter: Arabidopsis thaliana, økonomisk vigtig raps (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum). Trin-for-trin protokoller gives. Repræsentative resultater af patogenicitetsassays, transkriptionelle analyser af markørgener og uafhængige bekræftelser fra reporterkonstruktioner vises. Desuden diskuteres fordele og ulemper ved hvert podningssystem grundigt. Disse dokumenterede protokoller kan hjælpe med at give tilgange til forskningsspørgsmål om rod-mikrobe-interaktioner. At vide, hvordan planter håndterer mikrober i jorden, er afgørende for at udvikle nye strategier til forbedring af landbruget.
Introduction
Naturlig jord er beboet af et forbløffende antal mikrober, der kan være neutrale, skadelige eller gavnlige for planter1. Mange plantepatogener er jordbårne, omgiver rødderne og angriber det underjordiske organ. Disse mikroorganismer tilhører en lang række klader: svampe, oomycetes, bakterier, nematoder, insekter og nogle vira 1,2. Når miljøforholdene favoriserer infektion, vil modtagelige planter blive syge, og afgrødeudbyttet falder. Virkningerne af klimaændringer, såsom global opvarmning og ekstreme vejrforhold, vil øge andelen af jordbårne plantepatogener3. Derfor vil det blive mere og mere vigtigt at studere disse destruktive mikrober og deres indvirkning på fødevare- og foderproduktionen, men også på naturlige økosystemer. Derudover er der mikrobielle mutualister i jorden, der tæt interagerer med rødder og fremmer plantevækst, udvikling og immunitet. Når de konfronteres med patogener, kan planter aktivt rekruttere specifikke modstandere i rhizosfæren, der kan understøtte værtsoverlevelse ved at undertrykke patogener 4,5,6,7. Imidlertid er mekanistiske detaljer og veje involveret i gavnlige rod-mikrobe-interaktioner ofte stadig ukendte6.
Det er derfor vigtigt at udvide den generelle forståelse af rod-mikrobe-interaktioner. Pålidelige metoder til inokulering af rødder med jordbårne mikroorganismer er nødvendige for at udføre modelundersøgelser og overføre resultaterne til landbrugsapplikationer. Gavnlige interaktioner i jorden undersøges for eksempel med Serendipita indica (tidligere kendt som Piriformospora indica), nitrogenfikserende Rhizobium spp. eller mykorrhizale svampe, mens kendte jordbårne plantepatogener omfatter Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. og Verticillium spp.1. De to sidstnævnte er svampeslægter, der er globalt fordelt og forårsager vaskulære sygdomme2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan inficere hundredvis af plantearter – stort set dicotyledoner, herunder urteagtige enårige, træagtige stauder og mange afgrødeplanter 2,8. Hyfer af Verticillium kommer ind i roden og vokser både intercellulært og intracellulært mod den centrale cylinder for at kolonisere xylemkarrene 2,9. I disse fartøjer forbliver svampen i det meste af sin livscyklus. Da xylemsaften er næringsfattig og bærer planteforsvarsforbindelser, skal svampen tilpasse sig dette unikke miljø. Dette opnås ved udskillelse af koloniseringsrelaterede proteiner, der gør det muligt for patogenet at overleve i sin vært10,11. Efter at have nået rodvaskulaturen kan svampen spredes inden for xylemkarrene akropetalt til løvet, hvilket fører til systemisk kolonisering af værten 9,12. På dette tidspunkt påvirkes planten negativt i vækst 9,10,13. For eksempel forekommer stunting og gule blade samt for tidlig ældning 13,14,15,16.
Et medlem af denne slægt er Verticillium longisporum, som er stærkt tilpasset brassicaceous værter, såsom den agronomisk vigtige oliefrø raps, blomkål og modelplanten Arabidopsis thaliana12. Flere undersøgelser kombinerede V. longisporum og A. thaliana for at få omfattende indsigt i jordbårne vaskulære sygdomme og de resulterende rodforsvarsresponser 13,15,16,17. Ligetil modtagelighedstest kan realiseres ved hjælp af V. longisporum / A. thaliana modelsystemet, og veletablerede genetiske ressourcer er tilgængelige for begge organismer. Nært beslægtet med V. longisporum er patogenet Verticillium dahliae. Selvom begge svampearter udfører en lignende vaskulær livsstil og invasionsproces, er deres formeringseffektivitet fra rødder til blade og de fremkaldte sygdomssymptomer i A. thaliana forskellige: mens V. longisporum normalt inducerer tidlig ældning, resulterer V. dahliae-infektion i visning18. For nylig præsenterede et metodologisk resumé forskellige rodpodningsstrategier til infektion af A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, der hjælper med at planlægge eksperimentelle opsætninger19. I marken forårsager V. longisporum lejlighedsvis betydelig skade i rapsproduktionen12, mens V. dahliae har et meget bredt værtsområde bestående af flere dyrkede arter, såsom vinranke, kartoffel og tomat8. Dette gør begge patogener økonomisk interessante modeller at studere.
Således bruger de følgende protokoller både V. longisporum og V. dahliae som model rodpatogener for at eksemplificere mulige tilgange til rodpodninger. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), raps (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum) blev valgt som modelværter. Detaljerede beskrivelser af metoderne findes i teksten nedenfor og den ledsagende video. Fordele og ulemper for hvert podningssystem diskuteres. Samlet set kan denne protokolsamling hjælpe med at identificere en passende metode til specifikke forskningsspørgsmål i forbindelse med rod-mikrobe-interaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af de enorme udbyttetab forårsaget af jordbårne fytopatogener1 er der behov for en forbedring af landbrugsstrategier eller afgrødesorter. Den begrænsede indsigt i patogenesen af jordbårne sygdomme hindrer udviklingen af mere resistente planter. Underliggende pathomechanismer skal undersøges, for hvilke der kræves en robust metodologisk platform. Rapporterede podningsprocedurer har vist, at multifaktorielle hændelser i rod-mikrobe-interaktioner kan dissekeres godt ved at kombinere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Tim Iven og Jaqueline Komorek for tidligere arbejde med disse metoder, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institut for Farmaceutisk Biologi, University of Würzburg, Tyskland) for at levere det udstyr og de ressourcer, der er nødvendige for dette arbejde, og Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (begge University of Würzburg) til kritisk korrekturlæsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
