Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie
Summary
Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.
Abstract
In het menselijk lichaam vinden de meeste van de belangrijkste fysiologische reacties die betrokken zijn bij de immuunrespons en bloedstolling plaats op de membranen van cellen. Een belangrijke eerste stap in elke membraanafhankelijke reactie is binding van eiwit op het fosfolipidemembraan. Een benadering voor het bestuderen van eiwitinteractie met lipidembranen is ontwikkeld met behulp van fluorescerend gelabelde eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt de studie van eiwit-membraaninteracties mogelijk met behulp van levende cellen en natuurlijke of kunstmatige fosfolipide blaasjes. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Bij deze methode worden eiwitten gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Er kunnen echter zowel zelfgemaakte als commercieel verkrijgbare, fluorescerend gelabelde eiwitten worden gebruikt. Na conjugatie met een fluorescerende kleurstof worden de eiwitten geïncubeerd met een bron van het fosfolipidemembraan (microvesicles of cellen) en worden de monsters geanalyseerd door flowcytometrie. De verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om de kinetische constanten en het evenwicht Kd te berekenen. Bovendien is het mogelijk om het geschatte aantal eiwitbindingsplaatsen op het fosfolipidemembraan te schatten met behulp van speciale kalibratieparels.
Introduction
Biomembranen scheiden de inwendige inhoud van dierlijke cellen en extracellulaire ruimte. Merk op dat membranen ook microvesicles omringen die zijn gevormd tijdens de levenscyclus van de cel en organellen. Het celmembraan bestaat voornamelijk uit lipiden en eiwitten. Membraaneiwitten voeren signaal-, structurele, transport- en kleeffuncties uit. De lipide bilayer is echter ook essentieel voor de onderlinge relatie van de dierlijke cel met de extracellulaire ruimte. Dit artikel stelt een methode voor om de perifere interactie van externe eiwitten met het lipidemembraan te bestuderen.
Het meest treffende voorbeeld van reacties op de buitenste membraanlaag van een dierlijke cel is de bloedstollingsreactie. Een belangrijk kenmerk van bloedstolling is dat alle hoofdreacties plaatsvinden op de fosfolipidemembranen van cellen en microvesicles die uit deze cellen voortkomen en niet in het plasma 1,2,3. Membraanafhankelijke reacties omvatten het proces van het starten van coagulatie (op de celmembranen van het subendotheel, ontstoken endotheel of geactiveerde immuuncellen, met de deelname van een weefselfactor), alle reacties van de belangrijkste cascade-activering van factoren IX, X, protrombine; activering van factor XI door trombine (op de membranen van geactiveerde bloedplaatjes, erytrocyten, lipoproteïnen en microvesicles); reacties van de eiwit C-route; inactivatie van stollingsenzymen (op de membranen van endotheelcellen met de deelname van trombomodulinecofactoren, endotheeleiwit C-receptor, heparansulfaat); en contactwegreacties (op membranen van bloedplaatjes en sommige microvesicles met de deelname van onbekende cofactoren). Het is dus onmogelijk om bloedstolling te onderzoeken zonder de interactie van verschillende plasma-eiwitten met het membraan van bloedcellen te bestuderen.
Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met lipidemembranen van cellen of microvesicles. Deze aanpak werd aanvankelijk voorgesteld om de interactie van bloedplasma met bloedplaatjes en kunstmatige fosfolipideblaasjes te bestuderen. Bovendien interageren de meeste van de bestudeerde eiwitten direct met negatief geladen membraanfosfolipiden, met name met fosfatidylserine 4,5. Bovendien zijn er eiwitten waarvan de interactie met het membraan wordt gemedieerd door speciale receptoren6.
Een belangrijk vermogen van flowcytometrie is het onderscheiden van vrije en gebonden liganden zonder extra scheiding. Dit kenmerk van cytometrie maakt de studie van ligand-evenwichtsbinding op het eindpunt mogelijk en helpt bij het uitvoeren van continue kinetische metingen. De techniek is ongekunsteld en vereist geen complexe monstervoorbereiding. Flowcytometrie wordt actief gebruikt om de dynamiek van de interactie tussen fluorescerende peptiden, receptoren en G-eiwitten in intacte en detergent-permeabele neutrofielen kwantitatief te bestuderen7. Deze benadering is ook van toepassing voor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties en de kinetiek van endonuclease-activiteit in realtime8. In de loop van de tijd werd deze methode gebruikt om eiwit-eiwitinteracties met hoge affiniteit kwantitatief te bestuderen met gezuiverde lipideblaasjes9, of, meer in het algemeen, met membraaneiwitten uitgedrukt in een zeer efficiënt Sf9-celexpressiesysteem10. Kwantitatieve methoden zijn ook beschreven voor het karakteriseren van eiwit-liposoom interacties met behulp van flowcytometrie voor transmembraaneiwitten11.
Deze techniek maakt gebruik van zelfgemaakte kalibratieparels om te voorkomen dat in de handel verkrijgbare kralen wordengebruikt 7. De eerder gebruikte kalibratieparels7 waren bedoeld om te werken met fluoresceïne, wat het assortiment toegankelijke fluorescerende liganden op de eiwitten aanzienlijk beperkte. Bovendien biedt dit artikel een nieuwe manier om kinetische gegevens te verkrijgen en te analyseren voor een redelijke tijdsresolutie. Hoewel deze methode wordt beschreven voor kunstmatige fosfolipide blaasjes, zijn er geen duidelijke beperkingen voor het aanpassingsvermogen aan cellen, natuurlijke blaasjes of kunstmatige fosfolipide blaasjes met een andere lipidesamenstelling. De hierin beschreven methode maakt het mogelijk de parameters van interactie (kaan, kuit) en evenwicht (Kd) te schatten en vergemakkelijkt de kwantitatieve karakterisering van het aantal eiwitbindingsplaatsen op het membraan. Merk op dat deze techniek een geschatte schatting geeft van het aantal bindingsplaatsen. De voordelen van de methode zijn de relatieve eenvoud, toegankelijkheid en aanpasbaarheid aan inheemse cellen en natuurlijke en kunstmatige microvesicles.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voorgestelde methode kan worden aangepast voor een ruwe karakterisering van de interactie van eiwitten met fosfolipidemembranen uit verschillende bronnen en samenstellingen. De hier beschreven kwantitatieve flowcytometrie geeft toe aan oppervlakteplasmonresonantie (SPR) in verschillende parameters. In het bijzonder heeft het een lagere gevoeligheid en tijdresolutie en vereist het fluorescerende etikettering van eiwitten. Fluorescerende etikettering kan leiden tot een verandering in conformatie en verlies van activitei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs werden ondersteund door een subsidie van de Russian Science Foundation 20-74-00133.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF – Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
