在这里,我们提出了一种获得鸡胚胎的非冠状听觉脑干切片的协议,用于研究一个脑干切片内的异位特性和发育轨迹。这些切片包括矢状面、水平面和水平/横向切片,包括单个切片平面内较大的单位区域,而不是传统的冠状切片。
鸡胚是一种被广泛接受的用于研究听觉脑干的动物模型,由高度专业化的微电路和神经元拓扑组成,沿异位(即频率)轴差分定向。单位轴允许在喙内侧平面对高频声音进行隔离编码,在尾侧区域对低频编码进行隔离编码。传统上,胚胎组织的冠状脑干切片允许研究相对个体等频薄片。虽然足以研究与单个等频区域有关的解剖学和生理学问题,但对异位变异及其在较大听觉脑干区域的发展的研究有限。该协议报告了来自鸡胚胎的脑干切片技术,其中包括下听脑干中频率区域的较大梯度。鸡听觉脑干组织使用不同的切片方法允许在一个脑干切片中进行电生理和解剖学实验,其中比冠状切片更好地保存了更大的肌张力和发育轨迹梯度。多种切片技术可以改进对听觉脑干微电路的各种解剖学、生物物理和负直位特性的研究。
鸡胚是一种有价值的研究模型,可以研究细胞生物学、免疫学、病理学和发育神经生物学等众多不同科学领域的基本生物学问题。鸡听觉脑干的微电路是高度专业化回路的一个很好的例子,可以从听觉形态和生理学的角度来理解。例如,Rubel和Parks(1975)首先将鸡核Magnocellularis(NM)和核层流(NL)的异位取向(即频率梯度)描述为横跨细胞核轴的线性函数,相对于矢状面定向~30°。NM和NL中的单个神经元编码其最佳声音频率 – 称为其特征频率(CF) – 沿着口内侧平面到尾外侧区域。高频敏感神经元位于口内侧区域,低频敏感神经元位于尾侧。因此,传统的听觉脑干组织解剖方法来研究异位特性,利用了连续的冠状切片。事实上,几十年来,发育中的鸡胚胎的听觉微电路已被建立为研究通过连续尾部到喙冠平面脑干切片研究异位听觉功能的信号处理的模型系统1,2,3,4,5,6。
然而,NM和NL的异位组织在拓扑和形态上是复杂的。听觉神经输入的分布使得高 CF 输入终止于覆盖至少四分之一的 NM 细胞体周长的球内膜样结构。相反,低CF输入不是用末端球状终端组织的,而是在NM神经元的树突上具有多个布顿突触。中间CF输入终止为末端灯泡和布顿样突触4,7,8,9,10,11,12。在NL中,高度刻板的树枝状梯度不仅在树枝状长度上很明显,而且在树枝状宽度上也很明显。这种独特的树枝状梯度与轴缘紧密相连。从高CF神经元到低CF神经元,树突的长度分别增加了11倍,宽度增加了5倍6。为了克服这些细胞核在冠状切片中的这种复杂分布,该协议描述了矢状面、水平面和水平/横向平面中的解剖方法。这些切片技术提供了听觉脑干组织的例子,这些组织在单个切片平面中表现出最大的异位特性。
几十年来,鸡胚胎脑干组织的冠状切片允许研究相对个体等频薄片1,2,5。然而,鸡听觉脑干的异位(即频率)组织在拓扑上是复杂的,并且根据具体的研究问题在其他解剖轴上可能更容易获得。虽然足以研究与单个等频区域有关的解剖学和生理学问题,但对肌张力变化及其在较大听觉脑干区域的发展的研究在一定程度上受到冠状部分的限制。为了克服这一限制,该协议描述了矢状面,水平面和水平/横向平面的方法,以提供听觉脑干组织的其他示例,这些组织在单个脑干部分中表现出最大的异位特性和梯度。
听觉脑干区域的矢状面显示,与冠状切片相比,不同的肌张力区域分布在切片内的较大区域(矢状听觉面积= ~300-600μm,冠状听觉面积= ~200-350μm)。例如,NM和NL区域在矢状切片中沿前尾轴的较大区域上可视化(例如,图2B),并且沿该解剖轴延伸的功能异位梯度主要包含在单个矢状切片中。这进一步证实了这一点,电流钳记录了沿口尾梯度变化的内在神经元差异,如先前报道的14,15所示(例如,图3C,D)。未来突出沿肌腈轴的解剖学和免疫组织化学特性的实验可以进一步研究单个矢状切片平面内已知的听觉特性梯度。这些包括但不限于MAP2染色和钾通道表达模式,它们是树突结构的已知梯度以及NM和NL的内在特性,先前已在连续的冠状部分16中显示。
听觉脑干区域的水平部分显示NM和NL位于中线。一部分听觉轴索纤维对角线或垂直于水平面(图4)。这些纤维之后可以通过在矢状面上制作45°的急性角切片。由此产生的水平/横向切片大于矢状或水平切片,并且长轴突纤维穿过同侧和对侧的前尾轴。NM和NL都可以在较大的对角线区域(~400-700μm)中可视化,以便可以沿外侧 – 内侧轴观察对侧连接。此外,水平/横向切片平面还显示了听觉区域和由此产生的斜面梯度如何进行角度转弯(图 5)。对侧连接在更大区域内的角度暴露使得这些切片比传统的冠状切片更适合电生理刺激和微电路研究。
其他优势
听觉微电路的形成需要促进神经元存活、突触发生、轴突分化、树突结构和成熟的线索的时空协调。因此,鸡胚胎听觉微电路的替代脑干部分可用于以下研究课题:地形不同维度上神经元的形态组织;组织和绘制所有听觉和前庭核的连接体;识别和表征等频和异位平面中电路成分的活动模式;兴奋性与抑制性微电路的地形组织以及与特殊神经元群(细胞核)的关系;听觉核神经元的空间位置及其预测CF17;系统靶向特定的异位神经元类型;跟踪祖细胞及其发育为保守细胞核;细胞遗传谱系到神经元回路进化18;物种间脑干解剖学比较;研究前庭回路,如戴特前庭复合体(DC)19;以及前庭核之间的同步和串扰。
使用不同切片平面的多方面方法可能有助于回答有关脑干微电路未知解剖学和生物物理特性的基本问题。一个很好的例子是主要听觉核(NM、NA、NL 和 SON)和前庭核之间的关系,包括侧侧核 (LLDp)、半月核 (SLu)20 和切向核 (TN)3。然而,该协议和这些基于切片的研究确实存在一些局限性。
注意事项和限制
根据进行实验的机构,道德准则和鸡胚胎的处理可能会有所不同。虽然美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南允许快速斩首,但鸡胚胎安乐死还有其他方法21。与较老的胚胎相比,早期发育的鸡胚脑干组织柔软而脆弱。它的表面有几个连接和血管,在移除它们时需要格外小心。组织应保存在冰冷的dACSF中,并灌注95%O 2/5%CO2以增加活力。
矢状切片方法仅对同侧肌膜切除术有用。这种切片方法提供的切片比冠状切片更大,其处理可能不稳定。然而,人们可以使用在其他地方详细描述的十字针方法修剪切片22。使用4%LMP琼脂糖嵌段嵌入脑干可以保存切片中的精细结构,但必须注意不要倒入过热的琼脂糖。通过将琼脂糖阻断的脑干置于冷藏环境中~1分钟来快速设置它,使切片更适合电生理记录。
过量使用强力胶可能有毒。必须尽量减少使用,并且应通过更换dACSF立即清洗多余的量。对于急性角(45°)切片,切割琼脂糖块的角度至关重要;人们可以使用镜子看到前角,同时用锋利的刀片切割琼脂糖块。市售刀片可能具有蜡涂层,应在使用前用酒精擦拭并干燥。需要优化振动切片机切割速度和频率,因为轴突纤维簇比皮质或基质组织更硬。保持高振幅并使用冷冻解剖液可以防止组织损伤。
所有溶液应新鲜制备,在鼓泡95%O 2/5%CO2后,应将Ca 2+和Mg2+加入ACSF中。 否则,可能会有Ca2+的沉淀。应使用画笔轻轻处理振动切片机内的切片。如果可能,将总切片时间保持在 15 分钟以内。玻璃巴斯德移液器可用于操纵脑干切片。
请勿对接触电生理学切片的玻璃器皿和设备使用洗涤剂或腐蚀性清洗剂。拍摄的图像代表了微分干涉对比(DIC)光学器件下200-300μM厚组织的外观。视觉质量将比免疫组织化学或电子显微镜差,但它准确地反映了实验者在进行电生理记录时将看到的内容。
有关沿替代解剖轴的微电路早期发展的研究,无论是背-腹侧、口-尾还是同侧-对侧,都仅限于鸡听觉脑干。其中一个原因是转录代码的作用和脑干中异位发育的调节仍未完全了解。在 体外观察活动时,自上而下的调节和自发活动等功能现象经常丢失。然而, 体内 研究得到了仅在这些切片条件下才可能的特定和直接单神经元记录的补充。沿不同方向获得脑干组织的细化可以为鸡听觉脑干微回路中异位梯度的发展和复杂性提供有见地的信息。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH / NIDCD R01 DC017167资助的支持。我们感谢克里斯汀·麦克莱伦(Kristine McLellan)对手稿的早期版本提供编辑评论。
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