Her præsenterer vi en protokol til opnåelse af ikke-koronale auditive hjernestammeskiver af kyllingembryoet til undersøgelse af tonotopiske egenskaber og udviklingsbaner inden for en hjernestammeskive. Disse skiver inkluderer sagittale, vandrette og vandrette / tværgående sektioner, der omfatter større tonotopiske regioner inden for et individuelt skiveplan end de traditionelle koronale sektioner.
Kyllingembryoet er en bredt accepteret dyremodel til at studere den auditive hjernestamme, der består af højt specialiseret mikrokredsløb og neuronal topologi differentielt orienteret langs en tonotopisk (dvs. frekvens) akse. Den tonotopiske akse tillader segregeret kodning af højfrekvente lyde i det rostral-mediale plan og lavfrekvent kodning i caudo-laterale regioner. Traditionelt tillader koronale hjernestammeskiver af embryonalt væv undersøgelsen af relativ individuel isofrekvenslamina. Selvom det er tilstrækkeligt til at undersøge anatomiske og fysiologiske spørgsmål vedrørende individuelle isofrekvensregioner, er undersøgelsen af tonotopisk variation og dens udvikling på tværs af større auditive hjernestammeområder noget begrænset. Denne protokol rapporterer hjernestammeskæringsteknikker fra kyllingembryoner, der omfatter større gradienter af frekvensområder i den lavere auditive hjernestamme. Anvendelsen af forskellige udskæringsmetoder til kyllingens auditive hjernestammevæv tillader elektrofysiologiske og anatomiske eksperimenter inden for en hjernestammeskive, hvor større gradienter af tonotopiske egenskaber og udviklingsbaner bevares bedre end koronale sektioner. Flere udskæringsteknikker giver mulighed for forbedret undersøgelse af de forskellige anatomiske, biofysiske og tonotopiske egenskaber ved auditive hjernestammemikrokredsløb.
Kyllingembryoet er en værdifuld forskningsmodel til at studere grundlæggende biologiske spørgsmål inden for mange og forskellige videnskabelige områder, herunder cellebiologi, immunologi, patologi og udviklingsneurobiologi. Mikrokredsløbet i kyllingens auditive hjernestamme er et glimrende eksempel på et højt specialiseret kredsløb, der kan forstås med hensyn til auditiv morfologi og fysiologi. For eksempel beskrev Rubel and Parks (1975) først den tonotopiske orientering (dvs. frekvensgradient) af kyllingenurne magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL) som en lineær funktion over kernens akse, orienteret ~ 30 ° i forhold til sagittalplanet. Individuelle neuroner i NM og NL koder for deres bedste lydfrekvens – kendt som deres karakteristiske frekvens (CF) – langs det rostral-mediale plan til den caudo-laterale region. Højfrekvente følsomme neuroner er i den rostral-mediale region, og lavfrekvente følsomme neuroner er placeret caudo-lateralt. Som sådan har traditionelle dissektionsmetoder af auditivt hjernestammevæv til undersøgelse af tonotopiske egenskaber brugt successive koronale skiver. Faktisk er auditive mikrokredsløb til udvikling af kyllingembryoner blevet etableret som et modelsystem til undersøgelse af signalbehandling af tonotopiske auditive funktioner gennem successive kaudale til rostrale koronale plan hjernestammeskiver i årtier 1,2,3,4,5,6.
Imidlertid er den tonotopiske organisation af NM og NL topologisk og morfologisk indviklet. Auditive nerveindgange fordeles således, at høje CF-indgange slutter i endepærelignende strukturer, der dækker mindst en fjerdedel af en adendritisk NM-celles somatiske omkreds. Omvendt er lave CF-indgange ikke organiseret med endepærelignende terminaler, men med flere boutonsynapser på dendritter af NM-neuroner. Midterste CF-indgange slutter som både endepære og boutonlignende synapser 4,7,8,9,10,11,12. I NL er den meget stereotype dendritiske gradient tydelig ikke kun i dendritisk længde, men også i dendritisk bredde. Denne unikke dendritiske gradient er tæt i overensstemmelse med den tonotopiske akse. Dendritterne gennemgår en 11 gange stigning i længden og fem gange stigning i bredden fra henholdsvis høj- til lav-CF neuroner6. For at overvinde sådanne indviklede fordelinger af disse kerner i koronale skiver beskriver denne protokol dissektionsmetoder i de sagittale, vandrette og vandrette / tværgående planer. Disse udskæringsteknikker giver eksempler på auditivt hjernestammevæv, der udviser maksimale tonotopiske egenskaber i et individuelt skiveplan.
Koronale sektioner af kyllingembryonalt hjernestammevæv har tilladt undersøgelsen af relativ individuel iso-frekvens lamina i årtier 1,2,5. Imidlertid er den tonotopiske (dvs. frekvens) organisering af kyllingens auditive hjernestamme topologisk indviklet og kan være mere tilgængelig i andre anatomiske akser afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål. Selvom det er tilstrækkeligt til at undersøge anatomiske og fysiologiske spørgsmål vedrørende individuelle isofrekvensregioner, er undersøgelsen af tonotopiske variationer og dens udvikling på tværs af større auditive hjernestammeområder noget begrænset af koronale sektioner. For at overvinde denne begrænsning beskriver denne protokol tilgange i de sagittale, vandrette og vandrette / tværgående planer for at give yderligere eksempler på auditivt hjernestammevæv, der udviser maksimale tonotopiske egenskaber og gradienter i et individuelt hjernestammeafsnit.
Sagittale sektioner af auditive hjernestammeregioner viser, at forskellige tonotopiske områder er fordelt over en større region inden for skiven sammenlignet med koronale sektioner (sagittal auditivt område = ~ 300-600 μm, koronalt auditivt område = ~ 200-350 μm). For eksempel blev NM- og NL-regioner visualiseret over et større område langs rostro-kaudalaksen i sagittale sektioner (f.eks. Figur 2B), og den funktionelle tonotopgradient, der løber langs denne anatomiske akse, var stort set indeholdt i en enkelt sagittal skive. Dette blev yderligere bekræftet med aktuelle klemmeoptagelser af iboende neuronale forskelle, der varierer langs den rostrale-kaudale gradient som tidligere rapporteret14,15 (f.eks . Figur 3C,D). Fremtidige eksperimenter, der fremhæver anatomiske og immunohistokemiske egenskaber langs tonotopisk akse, kunne yderligere undersøge kendte gradienter af auditive egenskaber inden for et enkelt sagittalt skiveplan. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, MAP2-farvnings- og kaliumkanalekspressionsmønstre, som er kendte gradienter af dendritisk arkitektur og iboende egenskaber af NM og NL, der tidligere er vist i successive koronale afsnit16.
Vandrette sektioner af auditive hjernestammeregioner viser, at NM og NL er placeret mod midterlinjen. En del af auditive axonale fibre løber diagonalt eller vinkelret på det vandrette plan (figur 4). Disse fibre kan efterfølges ved at lave en akut vinkelskive 45 ° til sagittalplanet. De resulterende vandrette / tværgående skiver var større end sagittale eller vandrette skiver, og lange aksonale fibre løb gennem rostro-kaudalaksen til både ipsilaterale og kontralaterale sider. Både NM og NL kan visualiseres i et større diagonalt område (~ 400-700 μm), således at kontralaterale forbindelser kan visualiseres langs en lateral-medial akse. Derudover viser det vandrette/tværgående skiveplan også, hvordan de auditive regioner og den resulterende tonotopiske gradient laver en vinkeldrejning (figur 5). Vinkeleksponering af kontralaterale forbindelser i et større område gør disse skiver mere egnede til elektrofysiologisk stimulering og mikrokredsløbsundersøgelser end traditionelle koronale skiver.
Yderligere fordele
Dannelsen af auditive mikrokredsløb kræver spatiotemporal koordinering af signaler, der fremmer neuronal overlevelse, synaptogenese, axonal differentiering, dendritisk arkitektur og modning. Således kan en alternativ hjernestamme sektioner af kyllingembryo auditive mikrokredsløb anvendes til følgende forskningsemner: morfologisk organisering af neuroner i topografisk forskellige dimensioner; organisering og kortlægning af forbindelserne mellem alle auditive og vestibulære kerner; identifikation og karakterisering af aktivitetsmønstre for kredsløbsbestanddele i isofrekvens- og tonotopiske planer den topografiske organisering af excitatoriske versus hæmmende mikrokredsløb og relationer til specialiserede neuronpopulationer (kerner); rumlig placering af auditive kerneneuroner og dens forudsigelige CF17; systematisk målretning af specifikke tonotopiske neuronale typer; sporing af stamceller og deres udvikling til konserverede kerner; genetisk afstamning af celler til udviklingen af neuronale kredsløb18; sammenlignende hjernestamme anatomi mellem arter; undersøgelse af vestibulære kredsløb som Deiters vestibulære kompleks (DC)19; og synkronitet og krydstale mellem vestibulære kerner.
En mangesidet tilgang ved hjælp af forskellige skiveplaner kan hjælpe med at besvare grundlæggende spørgsmål om ukendte anatomiske og biofysiske egenskaber ved hjernestammemikrokredsløb. Et godt eksempel er forholdet mellem større auditive kerner (NM, NA, NL og SON) og de vestibulære kerner, herunder dorsalkernen i lateral lemniscus (LLDp), semilunar kernen (SLu) 20 og tangentiel kerne (TN)3. Denne protokol og disse skivebaserede undersøgelser har dog nogle begrænsninger.
Forholdsregler og begrænsninger
Afhængigt af den institution, der udfører forsøgene, kan etiske retningslinjer og håndtering af kyllingembryoner variere. Mens National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals tillader hurtig halshugning, er der alternative metoder til kyllingembryo-eutanasi21. Tidligt udviklende kyllingembryo hjernestammevæv er blødt og delikat sammenlignet med ældre embryoner. Det har flere forbindelser og blodkar på overfladen, der kræver ekstra forsigtighed, når de fjernes. Væv skal opbevares i iskold dACSF og perfunderes med 95% O 2/5% CO2 for at øge levedygtigheden.
Sagittal slicing-metoden er kun nyttig til ipsilateral tonotopi. Denne udskæringsmetode giver større skiver end koronale skiver, hvis håndtering kan være usikker. Man kan dog trimme skiverne ved hjælp af krydsnålsmetoder, der er beskrevet detaljeret andetsteds22. Brug af 4% LMP agarose blok indlejret hjernestamme kan redde sarte strukturer i skiver, men man skal passe på ikke at hælde for varm agarose. At indstille det hurtigt ved at placere den agaroseblokerede hjernestamme i et kølet miljø i ~ 1 minut gør skiver mere levedygtige til elektrofysiologiske optagelser.
Anvendelse af superlim i overskydende mængder kan være giftigt. Det skal påføres minimalt, og overskydende mængder skal vaskes straks ved at skifte dACSF ud. For akutte kantede (45 °) skiver er det kritisk at skære vinklen på agaroseblokken; Man kan bruge et spejl til at se frontvinklen, mens man skærer agaroseblokken med et skarpt blad. Kommercielt tilgængelige knive kan have en voksbelægning, som skal tørres af med alkohol og tørres før brug. Optimering er nødvendig for vibrationsskæringshastigheden og frekvensen, da axonale fibertufts er hårdere end kortikalt eller matrixvæv. At holde en høj amplitude og bruge kølet dissektionsopløsning kan forhindre vævsskade.
Alle opløsninger skal fremstilles friske, og Ca 2+ og Mg2+ skal tilsættes til ACSF efter boblende 95% O 2/5% CO2 . Ellers kan der være nedbør af Ca2+. En pensel skal bruges til at håndtere skiverne forsigtigt i vibratomet. Hold den samlede udskæringstid under 15 minutter, hvis det er muligt. En glas Pasteur pipette kan bruges til at manøvrere hjernestamme skiver.
Brug ikke vaskemiddel eller ætsende vaskemidler til glasvarer og udstyr, der kommer i kontakt med skiverne, der anvendes i elektrofysiologi. De billeder, der er taget, repræsenterer udseendet af 200-300 μM tykt væv under differentiel interferenskontrast (DIC) optik. Den visuelle kvalitet vil være dårligere end immunhistokemi eller elektronmikroskopi, men det afspejler nøjagtigt, hvad en eksperimentator vil se, når han udfører elektrofysiologiske optagelser.
Undersøgelser vedrørende den tidlige udvikling af mikrokredsløb langs en alternativ anatomisk akse, uanset om de er dorsal-ventrale, rostral-kaudale eller ipsilaterale-kontralaterale, er begrænsede i kyllingens auditive hjernestamme. En af grundene til dette er, at rollen som transkriptionskoder og regulering af tonotopisk udvikling i hjernestammen stadig ikke er fuldt ud forstået. Funktionelle fænomener som top-down modulering og spontan aktivitet går ofte tabt, når man observerer aktivitet in vitro. In vivo-forskning suppleres imidlertid med specifikke og direkte enkeltneuronoptagelser, der kun er mulige under disse skiveforhold. Forfining af at opnå hjernestammevæv langs forskellige orienteringer kunne give indsigtsfuld information om udviklingen og kompleksiteten af tonotopiske gradienter i kyllingens auditive hjernestammemikrokredsløb.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af NIH/NIDCD R01 DC017167-bevillingen. Vi takker Kristine McLellan for at give redaktionelle kommentarer til en tidligere version af manuskriptet.
Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533 | TMC | ||
Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
Chemicals- list | |||
Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |