Det nuvarande protokollet ger detaljerade beskrivningar för isolering, koncentration och karakterisering av extracellulära vesiklar från cyanobakteriella kulturer. Metoder för att rena vesiklar från kulturer i olika skalor, avvägningar mellan metoder och överväganden för att arbeta med fältprover diskuteras också.
Cyanobakterier är en mångsidig grupp fotosyntetiska, gramnegativa bakterier som spelar kritiska roller i globala ekosystem och fungerar som viktiga bioteknikmodeller. Nyligen utfört arbete har visat att både marina och sötvatten cyanobakterier producerar extracellulära vesiklar – små membranbundna strukturer som frigörs från mikrobernas yttre yta. Medan vesiklar sannolikt bidrar till olika biologiska processer, är deras specifika funktionella roller i cyanobakteriell biologi fortfarande i stort sett okända. För att uppmuntra och främja forskning inom detta område presenteras ett detaljerat protokoll för isolering, koncentration och rening av cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Det aktuella arbetet diskuterar metoder som framgångsrikt har isolerat vesiklar från stora kulturer av Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis. Metoder för att kvantifiera och karakterisera vesikelprover från dessa stammar presenteras. Metoder för att isolera vesiklar från vattenlevande fältprover beskrivs också. Slutligen diskuteras också typiska utmaningar med cyanobakteriell vesikelrening, metodologiska överväganden för olika nedströmstillämpningar och avvägningar mellan tillvägagångssätt.
Extracellulära vesiklar (EV) är sfäriska strukturer, som sträcker sig mellan ~ 20-400 nm i diameter, som frigörs av praktiskt taget alla organismer i sin omgivande miljö 1,2,3. Vesiklar avgränsas av ett lipid-dubbelskikt och kan inte replikera sig själva. I gramnegativa bakterier tros dessa strukturer främst uppstå genom “blebbing” av små portioner från det yttre membranet. Ändå kan andra processer, inklusive flagellärrörelse, celllys och utsöndring av både inre och yttre membranmaterial, också producera vesiklar 4,5. Elbilar kan innehålla olika biomolekyler, inklusive lipider, lösliga och membranproteiner, nukleinsyror och metaboliter, och kan transportera detta material mellan cellerna 4,5,6. Med tanke på dessa egenskaper studeras elbilar för att förstå deras möjliga roller i ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive cellulär kommunikation, biofilmbildning, horisontell genöverföring, värd-fagdynamik och näringsutbyte 4,6.
Cyanobakterier är en stor och mångsidig grupp av gramnegativa bakterier, inklusive encelliga och trådformiga organismer. De är av intresse ur många perspektiv, inklusive att förstå deras fysiologi och mångfald 7,8, de kritiska ekosystemfunktionerna de tjänar 9,10 och deras användbarhet för bioteknik11,12. Cyanobakterier finns i en mängd olika livsmiljöer, antingen som fritt levande organismer i marina, sötvattens- och markmiljöer, eller i symbiotiska föreningar med mossor, ormbunkar, växter eller i lavar och svampar13. De fungerar som viktiga primärproducenter i akvatiska ekosystem och producerar syre och organiskt kol genom syrefotosyntes 9,10, och vissa kan också fixera atmosfäriskt kväve7. Marina och sötvatten cyanobakterier, inklusive Prochlorococcus, Synechococcus och Synechocystis, producerar elbilar under laboratorieförhållanden 14,15,16, och cyanobakteriella vesiklar finns också i naturliga miljöer14,17. De biologiska och ekologiska funktionerna hos cyanobakteriella vesiklar är okända, men ytterligare forskning inom detta område kommer sannolikt att ge nya insikter i frågor om cyanobakteriell fysiologi, differentiering, kommunikationsstrategier, evolution och trofiska interaktioner. Dessutom kan förmågan hos cyanobakteriella elbilar att bära olika kategorier av biomolekyler ha kommersiella tillämpningar18,19.
Detta protokoll beskriver metoder för att isolera och karakterisera vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover för att möjliggöra och uppmuntra en bredare undersökning av cyanobakteriell extracellulär vesikelbiologi. Medan arbetsflödet som beskrivs här är analogt med protokoll för att isolera och karakterisera elbilar från andra bakterier, innehåller cyanobakteriella kulturer och fältprover vanligtvis lägre cell- och vesikelkoncentrationer än vad som vanligtvis observeras med värdassocierade eller patogena modellsystem 20,21,22. Studier av cyanobakteriella elbilar kräver därför särskilda överväganden och optimeringar för odling och vesikelisolering, som varierar ytterligare mellan stammar och mediebakgrund. Eftersom inget enskilt protokoll fungerar lika bra för alla stammar, tillväxtförhållanden och nedströmsapplikationer, tillhandahåller vi flera alternativ och diskuterar de avvägningar som är inblandade så att forskare kan bestämma de metoder som är mest lämpliga för att ta itu med deras experimentella frågor.
Allmänna överväganden
Protokollet (figur 1) presenteras som en uppsättning alternativ för att markera att det inte finns någon “one-size-fits-all” -metod för att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar. Intresserade forskare kan använda de delar av detta protokoll som är kompatibla och lämpliga för deras specifika modellorganism, experimentella frågor / mål och utrustningstillgänglighet. Alla vesikelisoleringsmetoder innebär avvägningar och kommer oundvikligen att resultera i en viss grad av partiskhet. Även om man bör försöka minimera detta när det är möjligt, är det viktigaste övervägandet att se till att den detaljerade metod som används rapporteras enligt lämpliga MISEV-riktlinjer (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.
Kultur tillväxt
Cyanobakteriella kulturer kan lätt erhållas från en av de många kultursamlingar som finns tillgängliga över hela världen. Några exempel är Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrike), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankrike) och Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den valda cyanobakteriella stammen måste odlas under lämpliga medium- och miljöförhållanden, som varierar avsevärt mellan olika stammar. En lista över vanliga medier för cyanobakteriell odling finns på kultursamlingswebbplatser eller andra publikationer 37,38,39.
Att arbeta med cyanobakteriella extracellulära vesiklar innebär några unika utmaningar jämfört med de metoder som rapporterats för många typiska heterotrofer i modelllaboratorier. Cyanobakteriella kulturer har vesikelkoncentrationer av storleksordningar lägre än de som finns i andra mikrober såsom Escherichia coli 14,16,40. Dessa skillnader, som förmodligen härrör från lägre celltätheter och / eller vesikelproduktionshastigheter, innebär att relativt stora kulturer (~ 1-20 L eller mer) kan krävas för att ge tillräckligt med material för bulkanalyser. Således uppmuntras forskare att testa vesikelutbyten från mindre kulturer för att bestämma hur mycket material som kommer att behövas för att uppnå sina önskade slutmål. Vikten av att fastställa om de medier som används för experimentet har en detekterbar partikelbakgrund måste också betonas innan ett experiment påbörjas, eftersom det materialet potentiellt kan förvirra vesikelpopulationskvantifieringen, minska känsligheten för vesikelkoncentration/ storleksmätningar eller förorena de slutliga vesikelpreparaten.
En annan utmaning för fältet är att inte alla cyanobakterier växer bra, eller alls, i ren kultur. Innan de görs axeniska kan tolkningar av fysiska vesikelegenskaper, produktionshastigheter eller innehåll inte nödvändigtvis leda till tydliga slutsatser om vesiklar som produceras av någon stam i samhället. Forskare rekommenderas också att överväga vilka andra typer av partiklar som kan vara närvarande och potentiellt förväxlas med vesiklar av specifika nanopartikelanalysverktyg, som inte nödvändigtvis kan skilja mellan olika partikeltyper. Det kan till exempel vara viktigt att verifiera att stammen som används saknar profag, antingen via genomsekvensering, induktionsanalyser eller på annat sätt eller inte släpper ut andra typer av partiklar. Enligt vår erfarenhet är de flesta cyanobakteriella vesiklar <0,2 μm i diameter, men när man tittar på en ny stam eller tillväxttillstånd bör man bekräfta om användning av ett filter på 0,45 μm porstorlek förändrar storleksfördelningen för renade partiklar.
Många aspekter av kulturförhållanden kan påverka vesikelproduktionen och dess innehåll 41,42. De fysikaliska och kemiska förhållanden som används för odlingstillväxt (inklusive lätt bestrålning, temperatur och mediesammansättning) måste därför dokumenteras och kontrolleras i den mån det är möjligt för att säkerställa resultatens reproducerbarhet. Varje kemisk analys av vesikelinnehåll måste ta hänsyn till bakgrundssammansättningen, särskilt vid utförande av analyser av hög genomströmning i “-omics”-stil. Detta kan vara särskilt viktigt när du använder odefinierade medier, såsom de som är baserade på en naturlig havsvattenbakgrund eller kompletteras med jästextrakt eller trypton. Att använda ett definierat tillväxtmedium kan vara att föredra beroende på de experimentella målen.
Forskare måste noggrant övervaka odlingstillväxtdynamiken med jämna mellanrum för att säkerställa att de vet var i tillväxtfasen en viss batchkultur är och inte bara samla in prover efter en godtycklig tid. Vesikelsammansättningen kan variera mellan tillväxtfaser, särskilt mellan exponentiella och stationära faser41,42. Till exempel kan åtminstone en viss bråkdel av vesiklar som provtas i den stationära fasen uppstå från en annan cellulär mekanism, såsom celllys, som inte kommer att inträffa under exponentiell tillväxt. Även om detta fortfarande kan vara av stort biologiskt intresse, är det viktigt att känna till provet. Om en cyanobakteriell odling når den önskade tillväxtfasen vid en tidpunkt då det inte är möjligt att gå direkt till provkoncentrationen rekommenderas att cellerna separeras från den <0,2 μm fraktionen omedelbart (med centrifugering och/eller direkt 0,2 μm filtrering) och sedan lagras det cellfria filtratet vid 4 °C. Materialet kan lagras på detta sätt i dagar med liten eller ingen märkbar inverkan på koncentrationen eller storleksfördelningen av vesiklar.
Vesikelrening
Det frekventa behovet av att isolera vesiklar från betydande volymkulturer är avgörande i arbetsflödet för cyanobakteriell vesikelisolering. Vid arbete med större volymer material måste vesiklarna koncentreras innan arbetsflöden för separation nedströms. Koncentratorer (tangentiella flödesfiltermembran eller centrifugalkolonner) med en nominell molekylviktgräns på 100 kDa rekommenderas i allmänhet, eftersom de möjliggör separation från lösligt material med låg molekylvikt samtidigt som koncentrationstiderna är rimliga, men 30 kDa-filter används också ofta med framgång. Medan flera icke-ultracentrifugeringsbaserade metoder för att rena vesiklar (t.ex. storleksuteslutningskromatografi, mikrofluidikbaserade system, affinitetsfångsttekniker och nederbördsbaserade tillvägagångssätt) blir populära i det extracellulära vesikelfältet, enligt vår erfarenhet, kan dessa tillvägagångssätt resultera i minskade utbyten och är vanligtvis oförenliga med de odlingsvolymer som behövs.
Forskare måste överväga sammansättningen av jodoxanolbakgrunden och de tvätt- / resuspensionsbuffertar som används vid vesikelrening för att säkerställa att de är kompatibla med de önskade nedströmsapplikationerna. I många fall kan det slutliga vesikelprovet återsuspenderas i tillväxtmedier eller en definierad buffert som är jämförbar i sammansättning med tillväxtmediet (t.ex. naturligt kontra artificiellt havsvatten). Detta kan dock inte vara möjligt med marina cyanobakteriella vesiklar, vilket kommer att kräva ytterligare experimentell manipulation för analys, eftersom höga saltkoncentrationer som liknar havsvattennivåerna kan hämma många enzymatiska reaktioner. I sådana fall fungerar standardlaboratoriebuffertar som 0,2 μm filtrerade, 1x PBS vanligtvis bra för att upprätthålla stabiliteten hos marina cyanobakteriella vesiklar och kan vara mer kompatibla med nedströms experimentella processer.
Densitetsgradientrening kan betraktas som valfri beroende på experimentella mål och odlingssammansättning men rekommenderas starkt för att producera ett mer rigoröst rent och reproducerbart prov. EV-populationer är heterogena och kan hittas över en rad flytande densiteter, som ytterligare varierar beroende på belastning, tillväxtförhållanden och andra faktorer 4,5,6. De densiteter som anges ovan representerar de som vanligtvis finns för vesiklar från cyanobakteriella kulturer och fältprover i jodoxanol, men resultaten i andra stammar kan variera. Andra densitetsgradientmaterial som sackaros och CsCl kan användas för vesiklar, men de kommer att migrera till olika flytande densiteter i dessa bakgrunder. Olika gradientmediabakgrunder kan påverka återhämtningen av lipidslutna virus43 och kan potentiellt påverka återhämtningen av vesiklar från olika stammar.
Vesiklar kan gå förlorade på flera punkter genom vesikelisolering och gradientreningsprocess som beskrivs här, vilket minskar utbytet och ökar mängden utgångsmaterial som behövs för att uppnå ett givet slutligt vesikelutbyte för nedströmsapplikationer. Särskild försiktighet bör iakttas vid arbete med vesikelpellets efter ultracentrifugering. Medan vissa cyanobakteriella vesiklar kan ha karotenoider eller andra föreningar som kan ge vesikelprover en viss mängd pigmentering (figur 2), beroende på stammen eller mängden material, förväntas det inte nödvändigtvis kunna visualisera vesiklarpelleten direkt. Var medveten om var pelleten förväntas vara med tanke på vilken typ av centrifugrotor som används. När så är möjligt föreslås renade vesikelprover undersökas med elektronmikroskopi för att verifiera sammansättningen av det slutliga material som återvunnits.
Lagringsförhållandenas inverkan på vesiklar och deras innehåll är fortfarande en öppen fråga. Även om det har visat sig att lagringen inte har någon märkbar effekt på cyanobakteriell vesikelstorlek eller koncentration14, kan funktionaliteten hos isolerade vesikelpreparat förändras över tiden44. Även om frys-/upptiningscykler bör undvikas när så är möjligt, verkar effekten av frysprover på det totala antalet fordon och storlekar vara minimal. Man bör vara medveten om potentialen för frys-tina cykler att påverka sammansättningen av vesikelinnehållet, såsom längden på vesikelassocierade nukleinsyror eller stabiliteten hos proteiner.
Vesiklar från field samples
Nuvarande metoder för att isolera extracellulära vesiklar från naturliga vattenmiljöer liknar konceptuellt och operativt de som beskrivs här för stora volymkulturer. Ändå kan de kräva ännu större volymer material. Sådana fältprover kan involvera insamling, filtrering och koncentration av hundratals till tusentals liter vatten för att erhålla tillräckligt med material för analys. Beroende på grumligheten hos det prov som används kan det behövas ett eller flera förfiltreringssteg före 0,2 μm-filtret. Den specifika TFF-anordning som används bör vara lämplig för att arbeta med så stora volymer inom rimlig tid (helst i storleksordningen timmar) och utan att sätta alltför stort tryck på provet. I praktiken innebär detta ofta att man använder en mycket större total ytarea än vad som kan tillämpas på odlingsbaserade prover, liksom slangar med större diameter för att underlätta ökade flödeshastigheter. Denna ökade filteryta kommer sannolikt att leda till en marginell ökning av partikelförluster jämfört med mindre TFF-arrangemang och en större slutlig volym koncentrat; Dessa farhågor måste dock vägas mot överväganden om den totala handläggningstiden. För situationer som en utökad oceanografisk kryssning där prover inte kommer tillbaka till ett laboratorium på många dagar efter provtagning rekommenderar vi att du utför initial 0,2 μm filtrering och TFF-steg i fältet. Denna mindre volym koncentrerat material kan sedan lagras vid 4 °C eller -80 °C ombord (beroende på tillgänglighet och analytiska överväganden nedströms) tills det returneras till laboratoriet för slutlig bearbetning.
Isolering och separation av extracellulära vesiklar från andra små partiklar, både organiska och oorganiska, kan vara utmanande, och metoder för att separera olika partiklar är ännu inte perfekta. Till exempel kan iodixanoldensitetsgradienter inte lätt separera alla klasser av vesiklar och virus som finns i ett givet prov. Eftersom typerna av förvirrande partiklar och deras fysikaliska egenskaper kommer att variera mellan provtagningsplatserna är det för närvarande omöjligt att tillhandahålla ett protokoll som robust delar upp alla klasser av små vattenpartiklar. Försök och fel är viktiga, och experiment med jodoxanolområdet som används i gradient- och ultracentrifugeringsförhållandena kommer att krävas för att maximera separationen; en samling mindre volymer, mer finupplösta densitetsfraktioner kan också krävas. Beroende på sammanhanget kan användning av CsCl-gradienter istället för jodoxanol hjälpa till att separera miljöpartiklar45. Ändå kan förändringen i osmotiska förhållanden leda till fördomar i de slutliga återvunna produkterna, som diskuterats ovan.
Vesikel karakterisering
Nanopartikelanalysinstrument är ännu inte rutinmässigt tillgängliga i mikrobiologiska laboratoriemiljöer men blir alltmer tillgängliga. Alla metoder har för- och nackdelar, och vi gör inget specifikt godkännande av en plattform som bättre än alla andra för cyanobakteriellt vesikelarbete; Faktum är att alla har särskilda avvägningar när det gäller kostnader, upplösning, användarvänlighet, detektionsgränser, kompatibilitet med olika tillväxtmedier / buffertbakgrunder och datareproduktion. Förutom instrument baserade på nanopartikelspårningsanalys som beskrivs ovan kan andra tillvägagångssätt, inklusive nanoflödescytometri, mikrofluidisk resistiv pulsavkänning och avstämbar resistiv pulsavkänning, tillämpas46,47. Användare bör vara noga med att lära sig detaljerna i deras tillgängliga instrumentering och verifiera att det fungerar bra med deras system, eftersom vi har stött på svårigheter när vi använder vissa plattformar med havsvattenbaserade medier. Vi uppmuntrar fältet att gå mot kvantitativ karakterisering av vesikelstorlek, koncentrationer och produktionshastigheter. Mätning av vesikelkoncentrationer på basis av en grundläggande partikel per ml, och inte i termer av proteininnehåll eller andra mätvärden, kommer att möjliggöra integrering av vesiklar i mer kvantitativa ramar och möjliggöra jämförelser mellan stammar och förhållanden. Ytterligare ansträngningar för att förbättra förmågan att kalibrera koncentrationsmätningar för <100 nm partiklar behövs.
Det faktum att mätningar av vesikelproduktionshastighet görs direkt från 0,2 μm filtrerad odlingssupernatant för att minimera partikelförluster skulle vara associerat med andra reningssteg som beskrivs ovan. Detta betyder dock att tillvägagångssättet inte nödvändigtvis diskriminerar mellan faktiska extracellulära vesiklar och andra små partiklar som finns i kulturerna. Endast räkning av partiklar inom specifika storleksintervall (t.ex. 50-250 nm diameter) kan hjälpa till att utesluta vissa avvikare, men visuell bekräftelse på att pelleterat <0,2 μm odlingsinnehåll verkar vara membranbundna vesiklar (med TEM eller andra metoder) behövs för att specifikt kunna hävda att man mäter produktionen av vesiklar i motsats till produktionen av vesikelliknande partiklar.
En väsentlig faktor vid vesikelkarakterisering är att säkerställa att vesikelprovet analyseras i lämpligt linjärt känslighetsområde för nanopartikelanalysanordningen. När ett prov är för koncentrerat är det enkelt att späda ut materialet med en ren buffert och analysera det igen. Å andra sidan kan den relativt låga cell- och/eller vesikeltätheten hos vissa cyanobakteriella kulturer ibland ge vesikelpreparat som ligger under vissa instruments detektionsgränser. I de fall där detta sker med vesikelrening i bulk kan man överväga att odla större volymkulturer, återpela och återsuspera det slutliga materialet i en mindre volym, eller utvärdera om det finns ett steg i isoleringsprocessen där alltför stora förluster uppstår och kan mildras. Vid mätning av vesikelproduktionshastigheter är korrigeringarna inte nödvändigtvis så enkla. Prover kan koncentreras vid behov, men den första bör se om justeringar av mediet kan leda till högre celltäthet eller om tillräckligt koncentrerade prover kan erhållas från senare tidpunkter under exponentiell fas där koncentrationerna blir högre.
Begränsningar
Som med alla protokoll har vesikelisolering med hjälp av dessa metoder tydliga begränsningar. Dessa tillvägagångssätt förlitar sig inte på deras garanti för att en helt ren beredning av vesiklar kommer att isoleras. Både kulturer och fältprover kan innehålla andra material, som migrerar på samma sätt som vesiklar i densitetsgradienter. Ändå är dessa typer av ytterligare reningsmetoder åtminstone väsentliga för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet av vesikelanalys. Medan vi beskriver vesikelisoleringsmetoder i samband med cyanobakterier, kommer kulturer av många andra mikrober också att innehålla vesiklar i relativt låga koncentrationer, och de förfaranden som beskrivs här bör vara allmänt tillämpliga. Det förväntas att dessa metoder inte kommer att fungera som ett permanent protokoll utan istället som en utgångspunkt för att stimulera framtida framsteg i arbetet med extracellulära vesiklar från olika mikrober. Framtida ansträngningar krävs för att slå samman dessa metoder med andra tillvägagångssätt som storleksuteslutningskolonner eller asymmetrisk fältflödesfraktionering för att förbättra diskrimineringen och separationen av olika kategorier av små partiklar från kulturer och miljöprover. Vi hoppas också att dessa tekniker kan fortsätta att utvecklas tillsammans med förbättringar i nanopartikelkarakteriseringstekniker för att förbättra förmågan att undersöka heterogenitet inom vesikelpopulationer, deras innehåll och deras exakta funktionella roller i miljön.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner stödet från i3S vetenskapliga plattformar “Biointerfaces and Nanotechnology” och “Histology and Electron Microscopy”, en medlem av den nationella infrastrukturen Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi tackar också prof. J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spanien) för att ha hjälpt till att optimera det ultratunna sektionsfärgningsprotokollet för TEM, och Dr. Cecília Durães och Dr. Ana Rita Pinto (University of Porto, Portugal) för nanopartikelspårningsanalysen.
Detta arbete finansierades av US National Science Foundation (OCE-2049004 till SJB), av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fonder genom COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, och av portugisiska medel genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 till PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia är också mycket erkänt för doktorandstipendiet SFRH / BD / 130478/2017 (SL) och FCT Investigator grant IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. stöddes av marie skłodowska-Curie-stipendiet (återintegreringspanelen) inom ramprogrammet Horisont 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Home-made buffer | — | Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially |
2% Uranyl acetate solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | Negative staining – TEM |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining |
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) | Merck | UFC9100XX | Alternative option for centrifugal ultrafiltration |
BG11 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803 |
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu | Electron Microscopy Sciences | 71150 | Transmission electron microscopy (TEM) grid |
easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000 | Commercial TEM grid glow discharger |
EMbed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Ultra-thin sections – TEM |
Filter holder for vacuum system | Thermo Fisher Scientific | 300-4000 | Reusable units with filter membrane support plates |
Glutaraldehyde Grade I | Sigma-Aldrich | G5882-10X1ml | Ultra-thin sections – TEM |
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] | Sigma-Aldrich | H7006 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Lead Citrate, Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | Stain for use in electron microscopy |
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K | Pall | MAP100C36 | For centrifugal ultrafiltration of small volume samples |
Millipore Pellicon 3 TFF Module | EMD Millipore | XX42P0060 or XX42P0080 | Alternative TFF option for concentrating large volume samples |
Milli-Q Reference Water Purification System | Merck | Z00QSV0WW | Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water |
NanoSight | Malvern Panalytical | LM14 or NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
Optima L80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L80 XP | Ultracentrifuge (or similar model) |
OptiPrep / Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Density gradient media |
Osmium Tetroxide Reagent Plus | Sigma-Aldrich | 201030 | Ultra-thin sections – TEM |
Pall Centramate PE TFF holder | Pall Corporation | FS002K10 | TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes |
Peristaltic pump Masterflex L/S | Cole-Parmer | 07559-07 | Pump for driving large-scale TFF modules |
Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments | 152-001 | Automated density gradient fractionation |
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 355618 | Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly |
Pro99 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Prochlorococcus |
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | P20495 | LPS staining |
SN medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250-100G | Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM |
SW32Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
SW60Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 335650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes |
Syringe 1mL Luer | BD Plastipak | 303172 | For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment |
Syringe filter 0.2 µm | Pall Corporation | 4602 | For vesicle isolation from cultures |
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | T5130 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Or similar microscope |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
Type XIV protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining |
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 344058 | Single use ultracentrifuge tubes |
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 344062 | Single use ultracentrifuge tubes |
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC | RMC Products, Boeckeler Instruments | 75501 | Microtome for ultra-thin sections – TEM |
Universal 320 R centrifuge | Hettich | Z654736 | This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells |
Vacuum apparatus | KNF Neuberger | N026.3 AT.18 | Or any similar vacuum pump and trap |
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES | Sartorius | VF20P4 | TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1). |
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) | Cytiva | 6717-9502 | Capsule filter for filtering large volumes of liquid |
Zetasizer | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | Dynamic light scattering (DLS) instrument |