Summary

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l’imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Abstract

Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.

Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca2+ di astrociti in coltura acutamente esposti all’immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all’ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall’aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca 2+ in hSOD1G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L’imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l’applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca2+. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca2+ e le tecniche di caricamento del colorante.

Introduction

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L’utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca2+ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.

La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori1. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)2. È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali3. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.

L’immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia 4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica7. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA7. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia6.

Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve8 e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA9. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD110) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura11, tessuti 12,13,14 o animali vivi 13. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici11.

Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all’applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS15. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell’infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale22,23,24.

Usiamo l’imaging video time-lapse di Ca2+ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca2+ nell’induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca 2+ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l’effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l’attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un’applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.

Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all’ATP, quest’ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca2+. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive UE sulla protezione degli animali per scopi scientifici e con il permesso della Commissione etica della Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (numero di approvazione EK-BF-2016/08). Per quanto riguarda il materiale del paziente (sieri per IgG), è stato raccolto per l’esame clinico di routine con il consenso informato del paziente in conformità con il Codice etico dell’Associazione medica mondiale (Dichiarazione di Helsinki) per gli esperi…

Representative Results

Caratterizzazione di diversi tipi di cellule gliali in colturaDi solito ci vogliono 15-21 giorni per produrre astrociti per gli esperimenti, mentre le cellule microgliali impiegano 10-15 giorni per crescere. L’immunocolorazione è stata eseguita per valutare la purezza cellulare della coltura. La Figura 1 mostra l’espressione della doppia marcatura del marcatore astrocitico GFAP e del marcatore microgliale Iba1 nelle rispettive colture. L’imag…

Discussion

Questo articolo presenta il metodo di coltura cellulare primaria come uno strumento veloce e “economico” per studiare diversi aspetti della fisiologia cellulare (pato) come la SLA nel modello di ratto hSOD1G93A . La tecnica è quindi adatta per studi a livello di singola cellula che possono essere estrapolati e ulteriormente studiati a un livello superiore di organizzazione (cioè in fette di tessuto o in un animale vivo). La coltura cellulare come tecnica, tuttavia, ha alcuni avvertimenti. È fondamentale ese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell’Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico Repubblica di Serbia Contratto n. 451-03-9/2021-14/ 200178, dal progetto FENS – NENS Education and Training Cluster “Corso Trilaterale sulla Glia nella Neuroinfiammazione” e dalla sovvenzione EC H2020 MSCA RISE #778405. Ringraziamo Marija Adžić e Mina Perić per aver fornito le immagini di immunoistochimica e Danijela Bataveljić per l’aiuto nella scrittura di articoli.

Materials

15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X – 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
  7. Li, J. -. Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Play Video

Cite This Article
Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

View Video