सेमीकंडक्टर आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर एन्यूप्लोइडी के लिए प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग
Summary
प्रोटोकॉल अर्धचालक-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच पर एन्यूप्लोइडी के लिए पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण में आवश्यक समग्र इन-लैब प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करता है। यहां हम प्रतिनिधि परिणामों के साथ पूरे जीनोम प्रवर्धन, डीएनए टुकड़ा चयन, पुस्तकालय निर्माण, टेम्पलेट तैयारी और अनुक्रमण कार्य प्रवाह के विस्तृत चरण प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने आनुवंशिक वेरिएंट के निर्धारण में नैदानिक अनुप्रयोग में बढ़ते महत्व को प्राप्त किया है। प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्ट में, इस तकनीक के स्केलेबिलिटी, थ्रूपुट और लागत में इसके अनूठे फायदे हैं। एन्यूप्लोइडी विश्लेषण के लिए पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण के लिए, यहां प्रस्तुत अर्धचालक-आधारित अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) प्रणाली 8 एमबी के न्यूनतम रिज़ॉल्यूशन पर संरचनात्मक आनुवंशिक वेरिएंट निर्धारित करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करती है। नमूना अधिग्रहण से लेकर अंतिम रिपोर्ट तक, कार्य प्रक्रिया को प्रोटोकॉल के करीब पालन के साथ कई चरणों की आवश्यकता होती है। चूंकि विभिन्न महत्वपूर्ण कदम प्रवर्धन के परिणाम, पुस्तकालय की गुणवत्ता, पढ़ने के कवरेज और डेटा के आउटपुट को निर्धारित कर सकते हैं, शब्दों के अलावा दृश्य प्रदर्शन के साथ वर्णनात्मक जानकारी ऑपरेशन और हेरफेर के लिए अधिक विवरण प्रदान कर सकती है, जिसका सभी महत्वपूर्ण चरणों के परिणामों पर बहुत प्रभाव पड़ सकता है। यहां प्रस्तुत विधियां बायोप्सीड ट्रोफेक्टोडर्म (टीई) कोशिकाओं, जीनोमिक लाइब्रेरी निर्माण, सीक्वेंसर प्रबंधन और अंत में, कॉपी नंबर वेरिएंट की रिपोर्ट उत्पन्न करने के पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) में शामिल प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करेंगी।
Introduction
एन्यूप्लोइडी एक या एक से अधिक अतिरिक्त गुणसूत्रों की उपस्थिति या एक या एक से अधिक गुणसूत्रों की अनुपस्थिति से गुणसूत्रों की संख्या में असामान्यता है। भ्रूण जो कुछ प्रकार के एन्यूप्लोइडी ले जाते हैं, जैसे कि एक एक्स गुणसूत्र (टर्नर सिंड्रोम), ऑटोसोम की अतिरिक्त प्रतियां, जैसे ऑटोसोम 21 (डाउन सिंड्रोम), 13 (पटाऊ सिंड्रोम), और 18 (एडवर्ड्स सिंड्रोम), या अतिरिक्त सेक्स गुणसूत्र जैसे 47, एक्सएक्सवाई (क्लाइनफेल्टर सिंड्रोम) और 47, एक्सएक्सएक्स (ट्रिपल एक्स सिंड्रोम), जन्म दोषके साथ जीवित रह सकते हैं। एन्यूप्लोइडी पहली तिमाही के गर्भपात और इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) विफलता का प्राथमिक कारणहै 2. यह बताया गया है कि आईवीएफ अभ्यास3 में प्राकृतिक चक्र और औषधीय नियंत्रण समूह की विभिन्न आयु परतों के माध्यम से एन्यूप्लोइडी दर 25.4% -84.5% तक हो सकती है।
अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक नैदानिक रूप से आनुवंशिक जानकारी के निर्धारण में बेतहाशा लागू हो रही है; यह दक्षता और उच्च थ्रूपुट के साथ जीनोम अनुक्रम तक व्यावहारिक पहुंच प्रदान करता है। विशेष रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने जीनोम 4 में असामान्यता के लिए आनुवंशिक कारकों और परीक्षणों के साथ विकारों के निदान में भी क्रांतिला दी। डिजिटल डेटा में जैव-प्रतिक्रिया अनुक्रमण में रासायनिक संकेतों को सीधे स्थानांतरित करने के लिए अर्धचालक अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करते हुए, अर्धचालक-आधारित अनुक्रम प्रणाली 3-7 घंटे 5,6 में अनुक्रम डेटा के लिए एक प्रत्यक्ष, वास्तविक समय का पता लगाने प्रदान करती है।
आईवीएफ प्रक्रिया में, पूर्व-आरोपण आनुवंशिक परीक्षण (पीजीटी) आईवीएफ परिणाम में सुधार करने और नवजात शिशुओं में आनुवंशिक विकारों के जोखिम को कम करने के लिए गर्भाशय में स्थानांतरित होने से पहले भ्रूण की आनुवंशिक प्रोफ़ाइल की जांच करता है। एनजीएस तकनीकों के साथ संयुक्त पीजीटी में, 10 से कम कोशिकाओं से निकाली गई आनुवंशिक सामग्री को पूरे जीनोम प्रवर्धन किट या स्वतंत्र रूप से विकसित पूरे जीनोम प्रवर्धन अभिकर्मक के साथ प्रवर्धित किया जाता है। इसके लिए प्रवर्धन चरण में केवल एक चरण की आवश्यकता होती है और पूरे जीनोम प्रवर्धन उत्पादों को प्राप्त करने के लिए पूर्व-प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं होती है। कॉपी नंबर संस्करण और विशेष जीन लोकी अनुक्रमण के लिए प्राइमर या पैनल बनाए गए पुस्तकालय में डिज़ाइन और लागू किए जाते हैं।
एनजीएस में प्री-इम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग-एन्यूप्लोइडी (पीजीटी-ए) के एक विशिष्ट वर्कफ़्लो में धारावाहिक प्रक्रियाएं शामिल हैं, और प्रयोगशाला कर्मियों के गहन कार्यभार की आवश्यकता होतीहै 8. प्रक्रिया रोल-बैक के कारण कुछ गलत संचालन से प्रयोगशाला के समय और संसाधनों दोनों का अवांछित नुकसान हो सकता है। पीजीएस-एनजीएस वर्कफ़्लो के लिए एक संक्षिप्त और स्पष्ट मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) सहायक है; हालाँकि, शब्द-प्रारूप प्रोटोकॉल नमूना प्रसंस्करण, डिवाइस हेरफेर और उपकरणों की सेटिंग्स पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रस्तुत नहीं कर सकते हैं, जिसे वीडियो प्रोटोकॉल में देखा जा सकता है। इस लेख में, ऑपरेटिंग विवरण के एक विज़ुअलाइज्ड प्रदर्शन के साथ संयुक्त एक मान्य वर्कफ़्लो अर्धचालक अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म पर पीजीटी अभ्यास में अधिक प्रत्यक्ष और सहज ज्ञान युक्त संदर्भ प्रोटोकॉल प्रदान कर सकता है।
यहां प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो समानांतर में 16 भ्रूण बायोप्सी तक बैचिंग का समर्थन करता है। बड़े बैचों के लिए, अर्धचालक अनुक्रमण के लिए एक वाणिज्यिक किट-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि रिप्रोस-पीजीएस।
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूण का क्रोमोसोमल एन्यूप्लोइडी गर्भावस्था के नुकसान के एक बड़े अनुपात का कारण है, चाहे स्वाभाविक रूप से या इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) में कल्पना की गई हो। आईवीएफ के नैदानिक अभ्यास में, यह प्रस्ताव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
झांगयोंग मिंग और श्री रोंगजी होउ को एलआईएमएस विस्तारित एप्लिकेशन पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। यह अध्ययन परिवार नियोजन के लिए पीएलए विशेष अनुसंधान परियोजनाओं (17जेएस008, 20जेएसजेड08), चयापचय रोग अनुसंधान की गुआंग्शी कुंजी प्रयोगशाला के फंड (संख्या 20-065-76), और गुआंगज़ौ नागरिक स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना (201803010034) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
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