Protokollen presenterer de generelle prosedyrene i laboratoriet som kreves i genetisk testing før implantasjon for aneuploidi på en halvlederbasert neste generasjons sekvenseringsplattform. Her presenterer vi de detaljerte trinnene for helgenomforsterkning, DNA-fragmentvalg, bibliotekkonstruksjon, malforberedelse og sekvensering av arbeidsflyt med representative resultater.
Neste generasjons sekvensering har fått økende betydning i den kliniske anvendelsen ved bestemmelse av genetiske varianter. I den genetiske testen før implantasjon har denne teknikken sine unike fordeler i skalerbarhet, gjennomstrømning og kostnad. For preimplantasjonsgenetisk test for aneuploidianalyse gir det halvlederbaserte neste generasjons sekvenseringssystemet (NGS) som presenteres her en omfattende tilnærming for å bestemme strukturelle genetiske varianter med en minimumsoppløsning på 8 Mb. Fra prøveinnsamling til sluttrapport krever arbeidsprosessen flere trinn med nær overholdelse av protokoller. Siden ulike kritiske trinn kan bestemme utfallet av forsterkning, kvaliteten på biblioteket, dekning av leser og utdata av data, kan beskrivende informasjon med annen visuell demonstrasjon enn ord gi mer detaljer til operasjonen og manipulasjonen, noe som kan ha stor innvirkning på resultatene av alle kritiske trinn. Metodene som presenteres her, vil vise prosedyrene som er involvert i helgenomforsterkning (WGA) av biopsierte trofektoverm (TE) celler, genomisk bibliotekkonstruksjon, sequencerhåndtering, og til slutt generering av kopinummervarianters rapporter.
Aneuploidy er abnormiteten i antall kromosomer ved tilstedeværelse av en eller flere ekstra kromosomer eller fraværet av ett eller flere kromosomer. Embryoer som bærer noen form for aneuploidi, for eksempel tap av ett X-kromosom (Turners syndrom), ekstra kopier av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) og 18 (Edwards syndrom), eller ekstra kjønnskromosomer som 47, XXY (Klinefelter syndrom) og 47, XXX (Triple X syndrom), kan overleve til termin med fødselsskader1. Aneuploidi er den primære årsaken til spontanaborter i første trimester og in vitro fertilisering (IVF) svikt2. Det er rapportert at aneuploidi-frekvensen kan variere fra 25,4% -84,5% gjennom de forskjellige alderslagene i den naturlige syklusen og medisinert kontrollgruppen i IVF-praksis3.
Neste generasjons sekvenseringsteknologi blir vilt brukt til å bestemme genetisk informasjon klinisk; Det gir praktisk tilgang til genomsekvens med effektivitet og høy gjennomstrømning. Spesielt revolusjonerte neste generasjons sekvensering også diagnosen lidelser med genetiske faktorer og tester for abnormitet i genomet4. Ved hjelp av halvledersekvenseringsteknologi for direkte overføring av kjemiske signaler ved sekvensering av bioreaksjon til digitale data, gir det halvlederbaserte sekvenssystemet en direkte sanntidsdeteksjon til sekvensdata i 3-7 timer 5,6.
I en IVF-prosedyre undersøker preimplantasjonsgenetisk testing (PGT) den genetiske profilen til embryoet før det overføres til livmoren for å forbedre IVF-utfallet og redusere risikoen for genetiske lidelser hos nyfødte 1,7. I PGT kombinert med NGS-teknikker forsterkes genetisk materiale ekstrahert fra mindre enn 10 celler med fullgenomforsterkningssett eller et uavhengig utviklet fullgenomamplifikasjonsreagens. Dette krever bare ett trinn i forsterkningsfasen og krever ikke forforsterkning for å oppnå fullgenomforsterkningsprodukter. Primere eller paneler for kopinummervariant og spesiell gen loci sekvensering er utformet og anvendt i biblioteket konstruert.
En typisk arbeidsflyt for preimplantasjon genetisk testing-aneuploidi (PGT-A) i NGS innebærer serielle prosedyrer, og krever en intens arbeidsbelastning av laboratoriepersonell8. Noen feiloperasjoner forårsaket prosedyren roll-back kan føre til uønsket tap av både tid og ressurser på laboratoriet. En kortfattet og tydelig standard driftsprosedyre (SOP) for PGS-NGS-arbeidsflyt er nyttig; Word-formatprotokoller kan imidlertid ikke presentere mer detaljert informasjon om prøvebehandling, enhetsmanipulering og instrumentinnstillinger, som kan visualiseres i en videoprotokoll. I denne artikkelen kan en validert arbeidsflyt kombinert med en visualisert demonstrasjon av driftsdetaljer tilby mer direkte og intuitive henvisningsprotokoller i PGT-praksis på en halvledersekvenseringsplattform.
Protokollen her beskriver en metode som støtter batching av opptil 16 embryobiopsier parallelt. For større partier anbefales det å bruke en kommersiell settbasert protokoll for sekvensering av halvledere, for eksempel Reproes-PGS.
Kromosomal aneuploidi av embryoer er årsaken til en stor andel av graviditetstap, enten unnfanget naturlig eller in vitro befruktning (IVF). I den kliniske praksisen med IVF foreslås det at screening av embryoaneuploidien og overføring av euploidi-embryoet kan forbedre utfallet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering er den tidligste teknikken som er vedtatt for kjønnsvalg og PGT-A; Denne teknikken krever imidlertid mer teknisk kompetanse fra laboratoriepersonell og er relativt arbeidskrevende. Ø…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Zhangyong Ming og Mr. Rongji Hou for deres råd om LIMS utvidet søknad. Denne studien støttes av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) og Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
dNTP | Vazyme | P031-AA | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |