Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.
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Methodenartikel
Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung ohne bekannte Heilung und ist durch anhaltende Entzündungen in vielen Organen, einschließlich der Nieren, gekennzeichnet. Unter solchen Umständen verliert die Niere ihre Fähigkeit, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und die Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren, was schließlich zu Nierenversagen führt. Frauen, insbesondere solche im gebärfähigen Alter, werden neunmal häufiger diagnostiziert als Männer. Nierenerkrankungen sind die häufigste Todesursache bei SLE-Patienten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Messung der ausgeschiedenen Proteinspiegel im gesammelten Urin und verfolgt das Fortschreiten des Lupus im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Isolierung mononukleärer Nierenzellen basierend auf der Auswahl von Größe und Dichte bereitgestellt, um die renale Infiltration von Leukozyten zu untersuchen. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Methode entwickelt, um die Proteinablagerung in den Glomeruli und die Leukozyteninfiltration im tubulointerstitiellen Raum zu charakterisieren. Zusammen können diese Methoden helfen, das Fortschreiten chronischer Entzündungen im Zusammenhang mit den Nieren von Lupus-anfälligen MRL / lpr-Mäusen zu untersuchen.
Einleitung
Die Hauptfunktion der Niere ist die Ausscheidung toxischer Substanzen durch den Urin unter Aufrechterhaltung der Homöostase von Wasser und Salzen1. Diese Funktion ist bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) bedroht, was zu einer sogenannten Lupusnephritis (LN) führt. LN ist eine Folge des Immunsystems, das die Niere angreift, was zu anhaltenden Nierenentzündungen führt und daher seine Fähigkeit verliert, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren. Dies führt schließlich zu Nierenversagen, das tödlich sein kann. Während des nephritischen Prozesses werden zirkulierende B-Zellen, T-Ze....
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Protokoll
Das vorliegende Protokoll wird vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt. Da die Lupuserkrankung bei Weibchen häufiger vorkommt, wurden nur weibliche MRL/lpr-Mäuse verwendet. Die Probenentnahme wurde im Alter von 4 Wochen begonnen und nach 15 Wochen beendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und gehalten.
1. Proteinurie-Test
- Sammeln Sie Urin, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Sterilisieren S....
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Ergebnisse
Das Protokoll verwendet mehrere Methoden, um MRL / lpr-Mäuse auf Lupusnephritis zu untersuchen. Zunächst wird ein Verfahren beschrieben, um erhöhte Proteinuriespiegel aufgrund von Nierenfunktionsstörungen im Laufe der Zeit zu untersuchen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurden weibliche Mäuse mit oraler Sonde von 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) als Kontrollgruppe und probiotischem Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe in einer Konzentration von 109 KB.......
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Diskussion
LN ist eine der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, und Faktoren, die die Krankheit verschlimmern, bleiben unklar. Die Anwendung dieses Protokolls besteht darin, die Nierenfunktion mit mehreren Methoden zu charakterisieren, einschließlich der Messung der Proteinurie, der FACS-Analyse isolierter Nierenleukozyten und der Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen Nierenabschnitten.
Ein wichtiger Punkt, der beim Sammeln von Urin zu beachten ist, ist, dass man mit der Tageszeit und dem Ort der.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken der Flow Cytometry Core Facility, dem Histopathology Laboratory, dem Fralin Imaging Center am Virginia Polytechnic Institute und der State University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764. K2 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Mensch/Maus C3 | Cedarlan | CL7632F | |
| Anti-Maus CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Maus CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Konfokalmikroskop LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin Tiegel | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Dichtegradient Medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Behandeltes Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Mikroskop Bildgebungssystem | Thermo Fisher | Scientific AMF5000 | |
| FACS Fusion Zellsortierer | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fötales Rinderserum - Premium, hitzeinaktiviertes | R& D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well-Platten aus Polystyrol | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad Prisma | GraphPad N | /A | |
| Hank' s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of | Health N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM nicht-essentielle Aminosäuren | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mäuse (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nagellack | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T. Compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Einweg-Einbettungsformen | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Puffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin Standard enthalten |
| ProLon Gold Antifade Eindeckmittel | ThermoFisher | P36934 | |
| Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR Block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Natriumpyruvat | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 Software |
| Sterile Zellsiebe 100 & Mikro; M | Fisher | Scientific 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycinhydrochlorid | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | Fluoreszenzfarbstoff für die Durchflusszytometrie-Analyse |
Referenzen
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
