डेमाइलिनेशन के पशु मॉडल में चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा माउस प्राथमिक माइक्रोग्लिया का अलगाव
Summary
यहां, हम कॉलमर चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग का उपयोग करते हुए, डिमाइलिनेटिंग बीमारियों के पशु मॉडल में प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में निवासी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सूजन या चोट के लिए प्राथमिक उत्तरदाता हैं। माइक्रोग्लिया को आराम की स्थिति और सक्रिय स्थिति में विभाजित किया जा सकता है और मस्तिष्क के माइक्रोएन्वायरमेंट के जवाब में तेजी से स्थिति बदल सकता है। माइक्रोग्लिया को विभिन्न पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत सक्रिय किया जाएगा और विभिन्न फेनोटाइप प्रदर्शित किए जाएंगे। इसके अलावा, सक्रिय माइक्रोग्लिया के कई अलग-अलग उपसमूह और विभिन्न उपसमूहों के बीच महान विषमता हैं। विषमता मुख्य रूप से माइक्रोग्लिया की आणविक विशिष्टता पर निर्भर करती है। अध्ययनों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया सक्रिय हो जाएगा और भड़काऊ डिमाइलिनेशन की रोग प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगा। मल्टीपल स्केलेरोसिस और न्यूरोमाइलाइटिस ऑप्टिका स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर जैसे भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया की विशेषताओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हम एक पेरिलेशनल प्राथमिक माइक्रोग्लियल सॉर्टिंग प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध प्राथमिक माइक्रोग्लिया प्राप्त करने और भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया के संभावित प्रभावों की जांच करने के लिए माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए कॉलमर चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) का उपयोग करता है।
Introduction
माइक्रोग्लिया जर्दी-थैली पूर्वजों से उत्पन्न होता है, जो भ्रूण मस्तिष्क तक बहुत जल्दी पहुंचजाता है और सीएनएस 1,2 के विकास में भाग लेता है। उदाहरण के लिए, वे सिनैप्टिक प्रूनिंग3 में शामिल हैं और अक्षीय विकास4 को विनियमित करते हैं। वे उन कारकों को स्रावित करते हैं जो न्यूरोनल अस्तित्व को बढ़ावा देते हैं और न्यूरोनल स्थानीयकरण 5 में मदद करतेहैं। इसी समय, वे सामान्य मस्तिष्क विकास6 सुनिश्चित करने के लिए असामान्य कोशिकाओं और एपोप्टोटिक कोशिकाओं को हटाने में शामिल हैं। इसके अलावा, मस्तिष्क की प्रतिरक्षा-सक्षम कोशिकाओं के रूप में, माइक्रोग्लिया लगातार मृत कोशिकाओं, बेकार सिनैप्स और सेलुलर मलबे7 को साफ करने के लिए मस्तिष्क पैरेन्काइमा की निगरानी करता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि माइक्रोग्लियल सक्रियण विभिन्न प्रकार की बीमारियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग रोग, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग और मस्तिष्क ट्यूमर शामिल हैं। मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) में सक्रिय माइक्रोग्लिया ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) के भेदभाव और माइलिन मलबे को घेरकर माइलिन के उत्थान में योगदान देताहै।
अल्जाइमर रोग (एडी) में, अमाइलॉइड बीटा (ए) का संचय माइक्रोग्लिया को सक्रिय करता है, जो माइक्रोग्लिया9 के फागोसाइटिक और भड़काऊ कार्यों को प्रभावित करता है। ग्लियोमा ऊतक में सक्रिय माइक्रोग्लिया, जिसे ग्लियोमा-संबद्ध माइक्रोग्लिया (जीएएम) कहा जाता है, ग्लियोमा की प्रगति को विनियमित कर सकता है और अंततः रोगियों के पूर्वानुमान को प्रभावित कर सकताहै 10. सक्रियण गहराई से माइक्रोग्लियल ट्रांसक्रिप्टोम को बदल देता है, जिसके परिणामस्वरूप रूपात्मक परिवर्तन, प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति, फागोसाइटिक गतिविधि में वृद्धि, और बढ़ी हुई साइटोकाइन स्राव11। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों जैसे रोग से जुड़े माइक्रोग्लिया (डीएएम), सक्रिय प्रतिक्रिया माइक्रोग्लिया (एआरएम), और माइक्रोग्लियल न्यूरोडीजेनेरेटिव फेनोटाइप (एमजीएनडी) 8 में सक्रिय माइक्रोग्लिया के विभिन्न सबसेट हैं।
इसी तरह, माइक्रोग्लिया के कई गतिशील कार्यात्मक सबसेट भी सूजन डिमाइलिनेटिंग रोगों12 में मस्तिष्क में सह-अस्तित्व में हैं। माइक्रोग्लिया के विभिन्न सबसेट के बीच विषमता को समझना भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों के रोगजनन की जांच करने और उनकी संभावित चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए आवश्यक है। माइक्रोग्लिया की विषमता मुख्य रूप से आणविक विशिष्टता8 पर निर्भर करती है। विषमता के अध्ययन के लिए माइक्रोग्लिया के आणविक परिवर्तनों का सटीक वर्णन करना आवश्यक है। एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) प्रौद्योगिकी में प्रगति ने पैथोलॉजिकल स्थितियों13 में सक्रिय माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं की पहचान को सक्षम किया है। इसलिए, विशिष्ट परिस्थितियों में इन लक्ष्य कोशिकाओं की आगे की जांच के लिए सेल आबादी को अलग करने की क्षमता महत्वपूर्ण है।
माइक्रोग्लिया की विशेषताओं और कार्यों को समझने के लिए किए गए अध्ययन आमतौर पर इन विट्रो अध्ययनों में होते हैं, क्योंकि यह पाया गया है कि माउस पिल्ला दिमाग (1-3 दिन पुराना) से बड़ी संख्या में प्राथमिक माइक्रोग्लिया तैयार और सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो संस्कृति फ्लास्क से जुड़ते हैं और अन्य मिश्रित ग्लियाल कोशिकाओं के साथ प्लास्टिक की सतह पर बढ़ते हैं। इसके बाद, शुद्ध माइक्रोग्लिया को मिश्रित ग्लियल कोशिकाओं14,15 के विभिन्न चिपकने के आधार पर अलग किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि केवल प्रसवकालीन मस्तिष्क से माइक्रोग्लिया को अलग कर सकती है और इसमें कई सप्ताह लगते हैं। सेल संस्कृति में संभावित चर सूक्ष्मग्लियल विशेषताओं जैसे आणविक अभिव्यक्ति16 को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, इन विधियों द्वारा अलग माइक्रोग्लिया केवल सीएनएस रोगों की स्थितियों का अनुकरण करके इन विट्रो प्रयोगों में भाग ले सकता है और विवो रोग राज्यों में माइक्रोग्लिया की विशेषताओं और कार्यों का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसलिए, वयस्क माउस मस्तिष्क से माइक्रोग्लिया को अलग करने के तरीकों को विकसित करना आवश्यक है।
प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय पृथक्करण दो व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं, हालांकि उनकी अपनी अलग-अलग सीमाएं 16,17,18,19 हैं। उनके संबंधित फायदे और नुकसान चर्चा अनुभाग में विपरीत होंगे। एमएसीएस प्रौद्योगिकी की परिपक्वता कोशिकाओं को तेजी से शुद्ध करने की संभावना प्रदान करती है। हुआंग एट अल ने मस्तिष्क20 में डिमाइलिनेटिंग घावों को लेबल करने के लिए एक सुविधाजनक विधि विकसित की है। इन दो तकनीकी दृष्टिकोणों को मिलाकर, हम एक तेजी से और कुशल कॉलमर सीडी 11 बी चुंबकीय पृथक्करण प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जो वयस्क माउस दिमाग में घावों को कम करने और माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं को संरक्षित करने के आसपास माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण विवरण प्रदान करता है। फोकल डिमाइलिनेटिंग घावों को प्रोटोकॉल 21 शुरू करने से 3 दिन पहले कॉर्पस कॉलोसम में लाइसोलेसिथिन समाधान (0.9% एनएसीएल में 1% एलपीसी) के2 μL के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के कारण हुआ था। यह प्रोटोकॉल इन विट्रो प्रयोगों में अगला कदम उठाने की नींव रखता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल समय बचाता है और विभिन्न प्रयोगों में व्यापक उपयोग के लिए संभव बना हुआ है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल डिमाइलिनेटिंग घावों के आसपास माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है, जो भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया की कार्यात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने में …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन को टोंगजी अस्पताल (एचयूएसटी) फाउंडेशन फॉर एक्सीलेंट यंग साइंटिस्ट (ग्रांट नंबर 2020वाईक्यू06) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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