Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu
Summary
Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Beyindeki yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) iltihaplanma veya yaralanmaya birincil yanıt verenlerdir. Mikroglia dinlenme durumuna ve aktif duruma ayrılabilir ve beynin mikro ortamına yanıt olarak durumu hızla değiştirebilir. Mikroglia farklı patolojik koşullar altında aktive olacak ve farklı fenotipler sergileyecektir. Ek olarak, aktif mikroglianın birçok farklı alt grubu ve farklı alt gruplar arasında büyük heterojenlik vardır. Heterojenlik esas olarak mikroglia’nın moleküler özgüllüğüne bağlıdır. Çalışmalar, mikroglia’nın aktive olacağını ve inflamatuar demiyelinizasyonun patolojik sürecinde önemli bir rol oynayacağını ortaya koymuştur. Multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın özelliklerini daha iyi anlamak için perilezyonel primer mikroglial sıralama protokolü öneriyoruz. Bu protokol, yüksek oranda saflaştırılmış primer mikroglia elde etmek ve mikroglia’nın moleküler özelliklerini korumak için kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı (MACS) enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglia’nın potansiyel etkilerini araştırmak için kullanır.
Introduction
Mikroglia, embriyonik beyne çok erken ulaşan ve CNS 1,2’nin gelişimine katılan yumurta sarısı kesesi progenitörlerinden kaynaklanır. Örneğin, sinaptik budama3 ve aksonal büyümeyi düzenleyen4’te rol oynarlar. Nöronal sağkalımı destekleyen ve nöronal lokalizasyona yardımcı olan faktörleri salgılarlar5. Aynı zamanda, normal beyin gelişimini sağlamak için anormal hücrelerin ve apoptotik hücrelerin çıkarılmasında rol oynarlar6. Ek olarak, beynin bağışıklık yetkin hücreleri olarak, mikroglia ölü hücreleri, işlevsiz sinapsları ve hücresel kalıntıları temizlemek için beyin parankimini sürekli olarak izler7. Mikroglial aktivasyonun, inflamatuar demiyelinizan hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve beyin tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Multipl sklerozda (MS) aktive mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC’ler) farklılaşmasına ve miyelin kalıntılarını yutarak miyelinin rejenerasyonuna katkıda bulunur8.
Alzheimer hastalığında (AD), amiloid beta (Aβ) birikimi, mikroglia9’un fagositik ve enflamatuar fonksiyonlarını etkileyen mikroglia’yı aktive eder. Glioma ile ilişkili mikroglia (GAM) adı verilen glioma dokusundaki aktif mikroglia, gliomun ilerlemesini düzenleyebilir ve sonuçta hastaların prognozunu etkileyebilir10. Aktivasyon mikroglial transkriptomu derinden değiştirir, morfolojik değişikliklere, immün reseptörlerin ekspresyonuna, fagositik aktivitenin artmasına ve sitokin sekresyonunun artmasına neden olur11. Nörodejeneratif hastalıklarda hastalıkla ilişkili mikroglia (DAM), aktif yanıt mikroglia (ARM) ve mikroglial nörodejeneratif fenotip (MGnD)8 gibi farklı aktif mikroglia alt kümeleri vardır.
Benzer şekilde, mikroglia’nın çoklu dinamik fonksiyonel alt kümeleri de enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda beyinde bir arada bulunur12. Mikroglia’nın farklı alt kümeleri arasındaki heterojenitenin anlaşılması, inflamatuar demiyelinizan hastalıkların patogenezini araştırmak ve potansiyel tedavi stratejilerini bulmak için gereklidir. Mikroglia’nın heterojenliği esas olarak moleküler özgüllüğe bağlıdır8. Heterojenliğin incelenmesi için mikroglia’nın moleküler değişikliklerini doğru bir şekilde tanımlamak esastır. Tek hücreli RNA dizileme (RNA-seq) teknolojisindeki ilerlemeler, patolojik koşullarda aktive mikroglianın moleküler özelliklerinin tanımlanmasını sağlamıştır13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarını izole etme yeteneği, bu hedef hücrelerin belirli koşullar altında daha fazla araştırılması için kritik öneme sahiptir.
Mikroglia’nın özelliklerini ve işlevlerini anlamak için yapılan çalışmalar genellikle in vitro çalışmalardır, çünkü kültür şişelerine bağlanan ve plastik yüzeyde diğer karışık glial hücrelerle birlikte büyüyen fare yavrusu beyinlerinden (1-3 günlük) çok sayıda birincil mikroglianın hazırlanabileceği ve kültürlenebileceği bulunmuştur. Daha sonra, saf mikroglia, karışık glial hücrelerin farklı yapışkanlığına dayanarak izole edilebilir14,15. Bununla birlikte, bu yöntem sadece mikroglia’yı perinatal beyinden izole edebilir ve birkaç hafta sürer. Hücre kültüründeki potansiyel değişkenler, moleküler ekspresyon16 gibi mikroglial özellikleri etkileyebilir. Dahası, bu yöntemlerle izole edilen mikroglia, yalnızca CNS hastalıklarının koşullarını simüle ederek in vitro deneylere katılabilir ve in vivo hastalık durumlarında mikroglia’nın özelliklerini ve işlevlerini temsil edemez. Bu nedenle, mikroglia’yı yetişkin fare beyninden izole etmek için yöntemler geliştirmek gerekir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik ayırma, kendi farklı sınırlamalarına sahip olmalarına rağmen, yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir16,17,18,19. İlgili avantaj ve dezavantajları tartışma bölümünde karşılaştırılacaktır. MACS teknolojisinin olgunlaşması, hücreleri hızla saflaştırma imkanı sunar. Huang ve ark. beyinlerdeki demiyelinizan lezyonları etiketlemek için uygun bir yöntem geliştirmişlerdir20. Bu iki teknik yaklaşımı birleştirerek, yetişkin fare beyinlerinde demiyelinizan lezyonlar etrafındaki mikrogliayı izole etmek ve mikroglia’nın moleküler özelliklerini korumak için adım adım bir açıklama sağlayan hızlı ve verimli bir sütunlu CD11b manyetik ayırma protokolü öneriyoruz. Fokal demiyelinizan lezyonlara, protokol 21’e başlamadan 3 gün önce korpus kallozuma 2 μL lizositin çözeltisinin (%0.9 NaCl’de %1 LPC) stereotaktik enjeksiyonu neden oldu. Bu protokol, in vitro deneylerde bir sonraki adımı gerçekleştirmek için temel oluşturur. Dahası, bu protokol zamandan tasarruf sağlar ve çeşitli deneylerde yaygın kullanım için uygun olmaya devam eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikrogliayı izole etmek için bir yöntem önermektedir, bu da inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın fonksiyonel özelliklerini incelemeye yardımcı olabilir. CD11b boncukları kullanılarak yakalanan mikroglia, yüksek saflık ve canlılık gösterir. Protokoldeki kritik adımlar, odakların hassas lokalizasyonunu ve optimal mikroglial saflaştırmayı içerir. Protokol adım 2.1’de, lezyonların doğru bir şekilde görüntülenebilmesini sağlamak i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Tongji Hastanesi (HUST) Mükemmel Genç Bilim İnsanı Vakfı (Hibe No. 2020YQ06) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
