Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Sommario

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Abstract

La Drosophila G-proteina accoppiata fotopigmento rhodopsin (R) è composta da una proteina (opsina) e un cromoforo. Il processo di attivazione della rodopsina è avviato dall'isomerizzazione del cromoforo che induce l'assorbimento dei fotoni, promuovendo cambiamenti conformazionali dell'opsina e determinando un secondo stato di fotopigmento scuro-stabile (metarodopsina, M). Lo studio di questo fotopigmento bistabile utilizzando la mutagenesi casuale richiede metodi semplici e robusti per lo screening delle mosche mutanti. Pertanto, sono stati progettati diversi metodi per misurare le riduzioni dei livelli di fotopigmento funzionale. Uno di questi metodi sfrutta gli spostamenti di carica all'interno del fotopigmento successivi all'assorbimento dei fotoni e le enormi quantità di molecole di fotopigmento espresse nei fotorecettori. Questo segnale elettrico, chiamato potenziale del recettore precoce (o corrente del recettore precoce), è misurato da una varietà di metodi elettrofisiologici (ad esempio, elettroretinogramma e registrazioni di intere cellule) ed è linearmente proporzionale ai livelli di fotopigmento funzionale. I vantaggi di questo metodo sono l'elevato rapporto segnale-rumore, la misurazione lineare diretta dei livelli di fotopigmento e l'indipendenza dei meccanismi di fototrasduzione a valle dell'attivazione della rodopsina o della metarodopsina. Un ulteriore metodo elettrofisiologico chiamato postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) sfrutta la bi-stabilità del fotopigmento di Drosophila e le differenze spettrali di assorbimento degli stati pigmentati R e M della mosca. Il PDA è indotto da un'intensa luce blu, che converte quantità saturanti di rodopsina in metarodopsina, con conseguente fallimento della terminazione della risposta alla luce per un tempo prolungato nell'oscurità, ma può essere terminato dalla metarodopsina alla conversione della rodopsina usando un'intensa luce arancione. Poiché il PDA è un segnale robusto che richiede una massiccia conversione del fotopigmento, anche piccoli difetti nella biogenesi del fotopigmento portano a PDA anormali prontamente rilevati. In effetti, i mutanti PDA difettosi hanno portato all'identificazione di nuove proteine di segnalazione importanti per la fototrasduzione.

Introduzione

La rodopsina (R) attivata dalla luce, che è un recettore accoppiato alla proteina G (GPCR), è composta da una proteina transmembrana 7 (opsina) e un cromoforo. In Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), l'assorbimento dei fotoni induce l'isomerizzazione del cromoforo 11-cis-3-OH-retinico a all-trans-3-OH-retinico¹, promuovendo il cambiamento conformazionale della rodopsina in metarodossina (M, Figura 1A). A differenza della rodopsina vertebrata, la frazione predominante del cromoforo invertebrato non si dissocia dall'opsina, con conseguente stato pigmentato fisiologicam....

Protocollo

1. Misurare la relazione di intensità di risposta, il postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) e il potenziale recettore precoce (ERP) utilizzando l'elettroretinogramma

1. Condizioni di allevamento adeguate per la preparazione di D. melanogaster
   1. Raise D. melanogaster vola in bottiglie contenenti mais giallo standard contenente alimenti in un'incubatrice mantenuta ad una temperatura di 24 °C e in un ciclo buio/luce di 12 ore
   2. Tenere le bottiglie di mosca al buio almeno 24 ore prima dell'esperimento.
2. Configurazione generale
   1. Preparare le pipette di registrazione tirando capill....

Risultati

La Figura 2 esemplifica la robustezza e la facilità di utilizzo della tecnica ERG. È robusto perché viene registrato nella mosca praticamente intatta con una semplice tecnica di registrazioni di tensione extracellulare che richiedono una semplice configurazione elettrofisiologica. La robustezza si manifesta ottenendo registrazioni di risposte luminose con ampiezze relativamente grandi (nell'intervallo millivolt) anche quando le mutazioni riducono o distorcono fortemente la risposta alla luce.......

Discussione

Il principale vantaggio dell'utilizzo della preparazione del fotorecettore Drosophila è la sua accessibilità, la facilità e l'accuratezza della stimolazione luminosa e, soprattutto, la capacità di applicare il potere della genetica molecolare⁷. Ampi studi genetici hanno stabilito Drosophila come un sistema modello estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi⁷. La struttura relativamente semplice del genoma di Drosophila.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 mL con punta			Figure 6M
1 pinzetta		Dumont #5, Standard	0,1 mm x 0,06 mm, lunghezza 110 mm, Inox (Figura 6H)
2 lenti
Convertitore A/D	Molecular Device	Digidata 1200	Possibile sostituzione: qualsiasi digidata da dispositivi molecolari (es. 1440A) -Figura 7C
Amplificatore	Elettronica		Possibile sostituzione: Warner instruments- IE251A o IE-210 (viene fornito con headstage)- Figura 7D
Tavolo antivibrante	Newport	VW-3036-OPT-01	Figura 7H
Capillari	Harvard Apparato	Capillari in vetro borosilicato	1 mm x 0,58 mm (Figura 6O)
Software del	dispositivo
Clampex CO2 serbatoio
Sorgente di luce fredda	Schott	KL1500 LCD	Figura 6C
Tergicristalli delicati	Kimtech		Kimwipes (Figura 6K)
Portaelettrodo			Adatto per diametro esterno capillare 1 mm (Figura 6N, Figura 7N e Figura 7P)
Gabbia di Faraday	Fatto		Schermatura dal rumore elettromagnetico e tendina frontale nera (Figura 7K)
Filtro (Colore)	Schott	OG590, Filtro Edge	Figura 7S
Filtro (Colore)	Schott	BP450/40 nm	Figura 7S
Filtro (Colore)	Blazers	550 nm	Figura 7S
Filtro (Colore) per sorgente di luce fredda	Schott	RG630	Figura 6C
Filtro (Calore)	Schott	KG3	Figura 7S
Filtri (Neutro Chroma		6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figura 7S
Sistema di lampade flash	Honeywell		Figura 7U
Sistema di traversine al volo con iniettore	Iniezione + matic		Figura 6A-B
Alimentazione lampada	PTI	LPS-220	Figura 7W
Rivelatore di luce	Fototransistor fatto in		(Figura 7O)
Guida di luce			Diametro 3 mm, lunghezza 1,3 m (Figura 7L,M)
Sorgente			Lampada allo xeno da 75 W priva di ozono ad alta pressione (funzionante a 50 W), possibile sostituzione: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera di fusione a bassa temperatura	Fatta in		Composto da una miscela di cera d'api (Tm≈ 62 gradi C) e paraffina a ~3:1 per raggiungere una temperatura di fusione di ~55– 56 gradi C (Figura 6J)
Supporto magnetico per mosche	Fatto		Figura 6I e Figura 7Q
Sistema di preamplificazione a microelettrodi con stadio di testa	Elettronica		Tester di impedenza (Figura 7G)
Micromanipolatore (meccanico grossolano)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipolatore (meccanico fine)	Leitz Microsystems	Leitz Micromanipolatore meccanico	Figura 7F
pCLAMP	Dispositivo		Software
Piastra			60 mm
Generatore di impulsi	AMPI	Master 8	Figura 7A
Crema Redux per elettrocardiografia	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crè me
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figura 7V
Shutter	System Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figura 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25– 1 mm di diametro, deve essere clorurato
Saldatore composto da un filamento			0,25 mm di diametro (Figura 6F)
Zoom stereoscopico Microscopio	Nikon	SMZ-2B	Figura 6D
Zoom stereoscopico Microscopio	Wild	Wild M5	Con impostazioni di ingrandimento 6, 12, 25 e 50 (Figura 7E)
Filtri per siringhe	Millex		22 e micro; m Filtro PVDF
Estrattore verticale per pipette	Sutter/Narishige	Modello P-97/PP-830	Utilizzare l'estrattore verticale o orizzontale, a seconda delle preferenze (Figura 6L)
Riscaldatore di filamenti di cera	Fatto in		Vedere la figura S1 (Figura 6E-G)
Sistema di lampade flash allo xeno	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figura 7X

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