Riktad laserablation i embryot till Saccharina latissima
Summary
Förstörelsen av specifika celler i embryot är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära interaktioner som är involverade i cellens öde. Detta protokoll beskriver tekniker för laserablation av riktade celler i det tidiga embryot till brunalgen Saccharina latissima.
Abstract
I Saccharina latissima utvecklas embryot som ett monolagerat cellark som kallas lamina eller bladet. Varje embryocell är lätt att observera, lätt att skilja från sina grannar och kan riktas individuellt. I årtionden har laserablation använts för att studera embryoutveckling. Här utvecklades ett protokoll för cellspecifik laserablation för tidiga embryon av brunalgen S. latissima. Det presenterade arbetet inkluderar: (1) beredning av Saccharina-embryon , med en beskrivning av de kritiska parametrarna, inklusive odlingsförhållanden, (2) laserablationsinställningarna och (3) övervakningen av den efterföljande tillväxten av det bestrålade embryot med hjälp av time-lapse-mikroskopi. Dessutom ges detaljer om de optimala förhållandena för att transportera embryona från bildplattformen tillbaka till laboratoriet, vilket kan påverka efterföljande embryoutveckling djupt. Alger som tillhör ordningen Laminariales uppvisar embryogenesmönster som liknar Saccharina; detta protokoll kan således enkelt överföras till andra arter i detta taxon.
Introduction
Laserablation har använts i årtionden för att studera embryoutveckling. Bestrålning av embryoceller med en laserstråle gör det möjligt att övervaka den regenerativa potentialen och modifieringen av celllinjen under embryogenesen och undersöka effekten av riktad ablation på celldelning och cellöde. Modellorganismerna som används i laserablationsmetoder är vanligtvis djur, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, ryggradsdjur 5,6 och ibland växter 7,8. Dessutom användes en lasermikroablationsmetod på brunalgen Fucus 1994 och 1998 för att demonstrera cellväggens roll i fotopolariseringen av det tidiga embryot 9,10.
Bruna alger tillhör gruppen Stramenopiles, divergerade vid roten av det eukaryota trädet för 1,6 miljarder år sedan. Som ett resultat är de fylogenetiskt oberoende av andra multicellulära organismer, såsom djur och växter11. Saccharina latissima tillhör ordningen Laminariales, mer allmänt känd som kelps, och de är bland de största organismerna på jorden och når storlekar på över 30 m. Saccharina sp. är en stor tång som används för många applikationer som mat och foder, och dess polysackarider extraheras för användning i jordbruks-, farmakologiska och kosmetiska industrier över hela världen12, 13. Dess odling, främst i Asien och på senare tid i Europa, kräver beredning av embryon i kläckerier innan ungdomar släpps ut i det öppna havet. Liksom alla kelps har den en bifasisk livscykel som består av en mikroskopisk gametofytisk fas, under vilken en haploid gametofyt växer och producerar gameter för befruktning och en diploid makroskopisk sporofytisk fas, där ett stort planblad utvecklas från sitt hållfast fäst vid havsbotten eller stenarna. Sporofyten frigör haploida sporer vid mognad och fullbordar därmed livscykeln 14,15,16.
S. latissima presenterar några intressanta morfologiska egenskaper17. Dess embryo utvecklas som ett monolagerat planark 15,18,19 innan det förvärvar en flerskiktad struktur som sammanfaller med framväxten av olika vävnadstyper. Dessutom är Laminariales en av de enda taxa av bruna alger vars embryon förblir fästa vid sin moders gametofytiska vävnad (Desmarestiales och Sporochnales gör också15). Denna funktion ger möjlighet att studera moderns vävnads roll i denna utvecklingsprocess och jämföra moderns kontrollmekanismer i bruna alger med de hos djur och växter.
Denna artikel presenterar det första kompletta protokollet för laserablation i ett tidigt kelpembryo. Detta protokoll som involverar UV-ns-pulserad teknik resulterar i specifik förstörelse av enskilda embryoceller för att studera deras respektive roller under embryogenesen. Förfarandet erbjuder ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att undersöka cellinteraktioner och cellöden under embryogenes i Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokal cellulär laserablation möjliggör tidsmässig och rumslig ablation med hög precision. Dess effektivitet kan emellertid hämmas av målcellernas bristande tillgänglighet; till exempel är alla celler av ett tredimensionellt embryo. Detta protokoll utvecklades på embryot av algen Saccharina latissima, som utvecklar en monolayered lamina där alla celler lätt kan särskiljas och förstöras individuellt med en laserstråle.
Laserkraft och våglängd
NIR fs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.:s doktorandstipendium finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH20020) och Sorbonne Université. I.T.is doktorandbidrag finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH18020) och Norvegian NMBU University. Detta projekt har fått ekonomiskt stöd från CNRS genom MITI:s tvärvetenskapliga program. MRic är medlem i den nationella infrastrukturen France-BioImaging som stöds av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
