Kryo-EM-kort over makromolekyler i høj opløsning kan også opnås ved hjælp af 200 kV TEM-mikroskoper. Denne protokol viser de bedste fremgangsmåder til indstilling af nøjagtige optikjusteringer, dataindsamlingsordninger og udvælgelse af billedbehandlingsområder, der alle er afgørende for en vellykket indsamling af datasæt i høj opløsning ved hjælp af en 200 kV TEM.
Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er blevet etableret som en rutinemæssig metode til bestemmelse af proteinstruktur i løbet af det sidste årti og har taget en stadigt stigende andel af offentliggjorte strukturelle data. De seneste fremskridt inden for TEM-teknologi og automatisering har øget både hastigheden af dataindsamlingen og kvaliteten af erhvervede billeder og samtidig reduceret det krævede ekspertiseniveau for at opnå cryo-EM-kort i opløsninger under 3 Å. Mens de fleste af sådanne højopløsningsstrukturer er opnået ved hjælp af state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemer, kan højopløsningsstrukturer også opnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, især når de er udstyret med et energifilter. Derudover reducerer automatisering af mikroskopjusteringer og dataindsamling med billedkvalitetsvurdering i realtid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopindstillinger, hvilket resulterer i øget udbytte af billeder i høj kvalitet og samlet gennemstrømning af dataindsamling. Denne protokol demonstrerer implementeringen af de seneste teknologiske fremskridt og automatiseringsfunktioner på et 200 kV kryotransmissionselektronmikroskop og viser, hvordan man indsamler data til rekonstruktion af 3D-kort, der er tilstrækkelige til de novo atommodelbygning. Vi fokuserer på bedste praksis, kritiske variabler og almindelige problemer, der skal overvejes for at muliggøre rutinemæssig indsamling af sådanne kryo-EM-datasæt i høj opløsning. Især følgende væsentlige emner gennemgås i detaljer: i) automatisering af mikroskopjusteringer, ii) udvælgelse af egnede områder til dataindsamling, iii) optimale optiske parametre til dataindsamling af høj kvalitet, høj gennemstrømning, iv) energifilterindstilling til nul-tabsbilleddannelse og v) datastyring og kvalitetsvurdering. Anvendelse af bedste praksis og forbedring af opnåelig opløsning ved hjælp af et energifilter vil blive demonstreret på eksemplet med apo-ferritin, der blev rekonstrueret til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstrueret til 2,1-Å opløsning ved hjælp af en 200 kV TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor.
Bestemmelse af proteinstruktur er afgørende for at forstå den molekylære arkitektur, funktion og regulering af proteinkomplekser involveret i vigtige cellulære processer, såsom cellemetabolisme, signaltransduktion eller værtspatogeninteraktioner. Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vist sig som en kraftfuld teknik, der er i stand til at løse 3D-strukturen af mange proteiner og deres komplekser, der var for udfordrende for de traditionelle strukturelle teknikker, såsom røntgendiffraktion og NMR-spektroskopi. Især er cryo-EM blevet bevist som den foretrukne metode til membranproteiner, som ikke let kan krystalliseres eller fremstilles i tilstrækkelige mængder til de traditionelle strukturelle teknikker, og gav ny indsigt i strukturen og funktionen af vigtige cellulære receptorer og ionkanaler 1,2,3,4,5 . Senest har cryo-EM spillet en vigtig rolle i bekæmpelsen af Covid-19-pandemien ved at bestemme mekanismen for SARS-CoV-2-infektion på molekylært niveau, som belyste oprindelsen af Covid-19-sygdommen og gav grundlaget for den hurtige udvikling af effektive vacciner og terapi 6,7,8,9,10.
Typisk anvendes high-end 300-kV transmissionselektronmikroskoper (TEM) til højopløsningsstrukturbestemmelse af biomolekyler ved kryo-EM enkeltpartikelanalyse (SPA) for at afsløre deres konformation og interaktioner. For nylig nåede SPA-teknikken en ny grænse, da den fælles benchmark cryo-EM-prøve apo-ferritin blev rekonstrueret ved atomopløsning (1,2 Å) 11,12 ved hjælp af en 300 kV TEM udstyret med koldfeltemissionspistolen (E-CFEG), en direkte elektrondetektor og et energifilter. Ved denne beslutning var det muligt entydigt at løse positioner af individuelle atomer i strukturen, konformation af individuelle aminosyresidekæder samt hydrogenbinding og andre interaktioner, hvilket åbner nye muligheder for strukturbaseret lægemiddelopdagelse af nye mål og optimering af eksisterende lægemiddelkandidater.
Mellemklasse 200 kV TEM-mikroskoper bruges ofte til prøvescreening og prøveoptimering inden endelig dataindsamling i høj opløsning ved hjælp af avancerede TEM-mikroskoper, især på større cryo-EM-faciliteter. Typisk kan afbildede prøver løses i opløsningsområdet 3-4 Å, der er tilstrækkeligt til at flytte til en avanceret 300-kV TEM til endelig dataindsamling. Derfor er dataindsamling ved hjælp af 200 kV TEM ofte ikke yderligere optimeret til de højest mulige opløsningsresultater. Desuden kan mange interessante biologiske spørgsmål allerede besvares og offentliggøres ved disse opløsninger, da alle aminosyresidekæder allerede er løst, og belægningen af ligandbindingssteder kan også bestemmes pålideligt13. Det er allerede blevet påvist, at 200 kV TEM’er kan nå opløsninger ud over 3 Å for adskillige prøver 14,15,16,17,18. Billeder taget ved 200 kV udviser i sagens natur højere kontrast af afbildede partikler, hvilket endda kan lette mere nøjagtig indledende justering af partiklerne på trods af mere dæmpet signal i høj opløsning sammenlignet med 300 kV TEM-billeder. Det er vigtigt at bemærke, at den opnåede opløsning af rekonstruerede cryo-EM-kort også er begrænset af strukturel fleksibilitet og konformationel heterogenitet af afbildede prøver, hvilket påvirker både 200 kV og 300 kV rekonstruktioner. Faktisk blev langt flere cryo-EM-rekonstruktioner opnået ved hjælp af 300-kV-systemerne løst i 3-4 Å-opløsningsområdet end ved højere opløsninger19. Da 200 kV TEM-mikroskoper er mindre komplekse og passer ind i mindre rum, repræsenterer disse mikroskoper en god, billigere mulighed for strukturbestemmelse af biologiske makromolekyler ved hjælp af cryo-EM, samtidig med at automatisering af lange dataindsamlinger fra flere prøver, der er gemt i mikroskopet Autoloader-systemet, bevares.
Indsamling af cryo-EM-datasæt til bestemmelse af struktur i høj opløsning kræver nøjagtig justering af mikroskopoptikken. Kolonnejusteringer foregår systematisk fra elektronkilden ned til kondensatorlinsesystemet, objektivlinsen og energifilteret med en elektrondetektor. Den fulde sekvens af justeringer er typisk ikke påkrævet. Når det er nødvendigt, guides brugeren via halvautomatiske procedurer med en korrekt beskrivelse af hvert trin i et kontekstbevidst hjælpevindue gennem hele justeringsproceduren i mikroskopets brugergrænseflade (Kontrolpanel for direkte justeringer). Når mikroskopet er fuldt justeret, forbliver elektronoptikken stabil, og justeringerne behøver ikke ændres i mindst et par måneder. Kun de mest følsomme justeringer, f.eks. parallel belysning af prøveplanet, objektiv bygningsfejl og komafri justering, skal finjusteres, lige før indsamlingen af hvert datasæt påbegyndes. Kvaliteten af indsamlede data kan derefter overvåges under dataindsamling ved hjælp af forskellige softwarepakker, såsom EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
Ud over nøjagtige justeringer af mikroskopet er den høje kvalitet af velrensede prøver med minimal konformationel og sammensætningsmæssig heterogenitet også en forudsætning for indsamling af datasæt i høj opløsning og løsning af højopløsningsstrukturer. Flere detaljer om typiske protokoller, hyppige udfordringer og mulige retsmidler kan findes i andre anmeldelser dedikeret til dette emne 25,26,27. I det væsentlige er det afgørende at finde områder på et givet cryo-EM-gitter, der har tilstrækkelig tynd is til at bevare information i høj opløsning, og individuelle partikler fordeles tæt i tilfældige retninger uden overlapninger. Typiske cryo-EM-gitre har dog ikke-ensartet istykkelse, og det er derfor vigtigt at finde og udvælge de optimale områder til billeddannelse. Forskellige midler til estimering af istykkelsen på nettet er tilgængelige i softwarepakker dedikeret til automatiseret indsamling af cryo-EM-datasæt, såsom EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Fremkomsten af hurtige og følsomme direkte elektrondetektorer muliggjorde indsamling af billeder i mange fraktioner som film, der muliggjorde kompensation for stråleinducerede bevægelser og resulterede i en betydelig stigning i kvaliteten og mængden af data, der blev brugt til billedbehandling og endelig 3D-rekonstruktion30. Samtidig giver automatisering og dataindsamling med høj kapacitet enorme datasæt med tusindvis af billeder /film, der repræsenterer udfordringer for datalagring og adgang. Den vedtagne model med store cryo-EM-faciliteter, der betjener titusinder til hundreder af brugere, kræver især organiseret datastyring med korrekt sporing og datadeling i etablerede cryo-EM-rørledninger31,32.
Denne undersøgelse beskriver en protokol til rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 kV Glacios TEM-mikroskopet. Nødvendige justeringer af mikroskopoptikken beskrives sammen med procedurer for evaluering af cryo-EM-prøver og udvælgelse af egnede områder til dataindsamling i høj opløsning. Organiseringen af indsamlede data og relaterede metadata med prøveoplysninger er demonstreret i Athena – en datastyringsplatform, der letter gennemgangen af prøveoplysninger og indsamlede data. Ved hjælp af musens apo-ferritinprøve var det muligt at opnå en 3D-rekonstruktion ved 1,6 Å-opløsning13. Ved hjælp af den beskrevne protokol rekonstruerede vi også 3D-densitetskortet over 20S-proteasomet fra Thermoplasma acidophilum ved 2,1 Å-opløsning.
Den beskrevne protokol forudsætter, at optikken i det anvendte TEM-mikroskop er i en veljusteret tilstand. For den 200 kV TEM, der anvendes i denne protokol, udføres, verificeres og gemmes sådanne kolonnejusteringer af en erfaren servicetekniker efter mikroskopinstallation eller enhver væsentlig serviceintervention. Disse justeringsindstillinger kan huskes når som helst i mikroskopets brugergrænseflade. Brugere kan bruge procedurerne for direkte justering i mikroskopets brugergrænseflade til at finjustere kritiske parametre igen. Nogle justeringer, såsom pistolhældning og pistolskift, er stabile og behøver ikke at blive justeret af brugerne dagligt. Kontrol og justering (hvis nødvendigt) af pistolhældning og -skift af mikroskopvejlederen anbefales to gange om året. På den anden side er nogle justeringer kritiske og skal justeres før hver dataindsamling som beskrevet i protokollen ovenfor (såsom objektiv bygningsfejl og komafri justering). Hvis Autocoma-funktionen i analysesoftwaren ikke konvergerer, skal justeringen af strålehældningsomdrejningspunkter og/eller rotationscenter verificeres og justeres, og den korrekte centrering af C2-blænden skal bekræftes. Bagefter skal Autostigmate-funktionen køres, da objektive stigmatatorer også bruges til komakorrektion. Disse justeringer skal itereres, indtil både Autostigmate og Autocomafunctions lykkes ved deres første iteration. Om nødvendigt kan der vælges et andet område (f.eks. understøtte kulfolie uden is), justeret billeddefokusering eller billedoptagelsestiden øges for at optimere signal-støj-forholdet i erhvervede billeder og synligheden af flere Thon-ringe i Fourier-transformationen af de erhvervede billeder.
Moderne cryo-EM-mikroskoper genererer store mængder data, der ofte overstiger 1 TB pr. datasæt for at opnå 3D-rekonstruktioner i høj opløsning, især for proteiner med lav symmetri. Cryo-EM data og resultater suppleres også typisk med data og resultater fra ortogonale metoder for fuldt ud at forstå struktur-funktionsrelationer i hvert videnskabeligt projekt. Organisering af indsamlede data, deres overførsel til en billedbehandlingspipeline og deling af en resulterende cryo-EM-rekonstruktion blandt samarbejdspartnere stiller yderligere krav til nye adoptere af cryo-EM-metoden til at oprette deres lokale it-infrastruktur. Datastyringssoftware, såsom Athena, letter centraliseret lagring af data erhvervet af ethvert tilsluttet instrument eller software, der drives af en registreret bruger. Lagrede data og metadata er tilgængelige ved hjælp af en simpel webbrowsergrænseflade for flere brugere, som kan have forskellige roller i projektet med forskellige adgangsrettigheder (enten som ejer, samarbejdspartner eller seer) baseret på deres loginoplysninger og datadelingsdefinition i eksperimentopsætningen. Denne digitalisering af eksperimentelle arbejdsgange giver mulighed for data- og metadatadeling mellem samarbejdspartnere uden unødvendig overlapning og øger produktiviteten og sporbarheden af brugte arbejdsgange. Implementering af en generel og tilpasselig struktur af projekter, eksperimenter og arbejdsgange i datastyringssoftware er universel og giver mulighed for tilpasning og integration af ortogonale eksperimenter ved hjælp af komplementære metoder i en enkelt projektdatabase.
Udvælgelsen af områder til dataindsamling på et cryo-EM-net er afgørende for en vellykket erhvervelse af datasæt i høj opløsning. Cryo-EM-gitre produceret med traditionelle dykfrysningsanordninger, såsom Vitrobot (et fuldautomatisk forglasningssystem), vil typisk vise en gradient af istykkelse over gitteroverfladen (figur 4). Dette kan være en fordel, da gitteret indeholder områder med forskellige istykkelser; Områder med den ideelle istykkelse til dataindsamling skal dog identificeres som beskrevet i protokollen ovenfor. Et optimalt cryo-EM-gitter skal indeholde så lidt overførselsisforurening som muligt og indeholde nok gitterfirkanter med intakt hullet støttefolie. Indsamling af data om gitterfirkanter, der har revner eller ødelagte områder, anbefales ikke, da indsamlede billeder vil blive påvirket af betydeligt stærkere samlet afdrift ved belysning af en elektronstråle sammenlignet med gitterfirkanterne med intakt støttefolie. Overskud af krystallinsk is kan okkludere størstedelen af foliehullerne og/eller forstyrre autofokusering, og sådanne gitterfirkanter bør også undgås. Gitterfirkanter med tynd is udviser normalt store glasagtige områder og mange lyse foliehuller, der er synlige på et billede taget ved hjælp af Atlas-forudindstillingen. Forekomsten af tykkere is tæt på gitterstænger må forventes og er ukritisk, da foliehuller i disse områder af gitterkvadreret er udelukket under huludvælgelsesproceduren. Tilstedeværelsen af flere tomme huller i en gitterfirkant kan betyde, at glasagtig is i de omgivende huller er ekstremt tynd og kan indeholde beskadigede partikler eller slet ingen partikler. Generelt er det klogt at vælge gitterkvadrater med en række istykkelser i forskellige regioner på nettet til indledende screening og vurdering for at forstå, hvilke områder der har de bedste betingelser for dataindsamling i høj opløsning og udvise den ideelle partikeltæthed og orienteringsfordeling. For apoF- og 20S-proteasomprøverne, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder områder med den tyndeste observerbare is de bedste betingelser for billeddannelse i høj opløsning af disse prøver.
Når du vælger huller automatisk i alle valgte gitterfirkanter ved hjælp af dataindsamlingssoftwaren, anbefales det at udføre skabelonudførelsesopgaven på et repræsentativt hul i hver gitterfirkant for at kontrollere og sikre, at der hverken blev valgt alt for tykke eller alt for tynde eller uventet ikke-glasagtige firkanter til dataindsamling. Under dataindsamling kan nøglekvalitetsindikatorer for indsamlede billeder, såsom billeddrift og CTF-tilpasning, overvåges ved hjælp af EQM. Dataindsamling kan derefter optimeres ved at springe over områder, der giver billeder af dårlig kvalitet. Billeder med CTF-tilpasninger i høj opløsning kan dog stadig indeholde billeder med partikler i nogle få foretrukne retninger eller partikler denatureret i et for tyndt islag. Partikelplukning i realtid og 2D-klassificering fra indsamlede billeder ville give yderligere oplysninger om kvaliteten af strukturelle data i afbildede partikler og afsløre både foretrukne orienteringer af intakte partikler i is eller inkonsekvent struktur af (delvist) denaturerede partikler. Beregning af klassegennemsnit kan derfor bidrage til yderligere at forfine passende regioner til dataindsamling, som det allerede er blevet implementeret og vist i andre softwarepakker23,28.
Udvælgelsen af billeddannelsesindstillingerne for dataindsamling, såsom forstørrelse, elektrondosishastighed og defokusområde, afhænger af flere kriterier, såsom målopløsning, proteinets størrelse, prøvekoncentration, ønsket mikroskopgennemstrømning osv. For det direkte elektrondetektorkamera, der blev anvendt i disse eksperimenter, blev elektrondosishastigheden valgt i området 4-5 e–/pix/s ved at vælge en passende SPOT-størrelse og intensitet for at opretholde parallel belysning. Som vist i tabel 1 kan der anvendes en anden SPOT-størrelse i forudindstillingen Hole/Eucentric Height for at sikre et tilstrækkeligt signal-støj-forhold i billedet til centrering af huller under dataindsamling. Forstørrelsen skal vælges således, at pixelstørrelsen er mindst 2-3x mindre end målopløsningen for cryo-EM-rekonstruktionen. Den højere forstørrelse (dvs. mindre pixelstørrelse) bruges imidlertid, det mindre synsfelt fanges i billeder, og der er færre partikler pr. Billede, hvilket i sidste ende fører til længere dataindsamlingstid til at indsamle billeder med nok partikler til at rekonstruere 3D-kort til en høj opløsning. Til apoF-prøven brugte vi pixelstørrelsen på 0,43 Å, da vi havde tilstrækkelig prøvekoncentration til høj densitet af partikler i billeder og sigtede mod sub-2 Å-opløsning af rekonstruktionen. Til 20S-proteasomprøven brugte vi pixelstørrelsen på 0,68 Å til at dække et større synsfelt på erhvervede billeder. Typisk for 200 kV TEM-mikroskoper erhverves cryo-EM-billeder i defokusområdet fra 0,8 til 2,0 μm. Men med det forbedrede kontrast- og signal-støj-forhold ved hjælp af energifilteret kan dataindsamlinger udføres meget tættere på fokus for bedre at bevare information i høj opløsning i erhvervede billeder på grund af mindre afvigelser og tilsvarende reduceret henfald af CTF-konvolutfunktionen. Vi bruger heller ikke en objektiv blændeåbning, da blænden kan introducere yderligere billedaberrationer, mens billedkontrasten allerede er tilstrækkeligt forbedret ved hjælp af energifilteret. Til apoF- og 20S-proteasomprøverne brugte vi defokuseringsindstillingerne på 0,5 μm, 0,7 μm og 0,9 μm. For mindre proteiner (<200 kDa) brugte vi defokuseringsindstillinger på -0,5 μm, -0,7 μm og -0,9 μm for at forbedre partiklernes kontrast og lette partikelplukning og indledende grov justering i 3D-forfiningstrinnet i 3D-rekonstruktion, hvilket førte til ~ 2,5 Å-opløsning 3D-kort (upublicerede resultater).
Vi har allerede vist, at billeddannelse med et energifilter forbedrer signal-støj-forholdet (SNR) i cryo-EM-billeder indsamlet på de avancerede 300-kV TEM-mikroskoper11. Faktisk, når elektroner passerer gennem en prøve, forekommer der to hovedtyper af interaktioner: i) Elastisk spredte elektroner opretholder deres energi og bidrager til billeddannelse ved interferens med den ikke-spredte indfaldende stråle via fasekontrastmekanismen ii) uelastisk spredte elektroner mister noget energi i prøven og bidrager hovedsageligt til støj i billeder. Derfor kan SNR forbedres betydeligt ved at filtrere de uelastisk spredte elektroner, som har lavere energi end den indfaldende stråle og elastisk spredte elektroner ved hjælp af en smal energispalte. Det er imidlertid afgørende at bruge et tilstrækkeligt stabilt energifilter, såsom Selectris eller Selectris-X, til at kunne bruge meget smalle (10 eV eller mindre) slidser over lange (12+ timer) automatiseret dataindsamling af kryoEM-datasæt med høj opløsning.
Cryo-EM-billeder erhvervet med 200 kV TEM-mikroskoper under de samme betingelser som med 300 kV TEM-mikroskoper udviser mindre SNR ved høj opløsning (især <4 Å) på grund af hurtigere henfald af CTF-konvolutfunktionerne. Derfor kræves et højere antal partikler (og derfor et højere antal indsamlede billeder) for at opnå en vis opløsning, når der anvendes 200 kV TEM'er. Derudover er dybdeskadslen (10-25 nm i opløsningsområdet 2-3 Å) også ca. 20% mindre i 200 kV-billeder35, hvilket betyder, at færre partikler i islaget (typisk 20-50 nm tykke) vil være fuldt i fokus og konstruktivt bidrage til alle højopløsningsfunktioner i en beregnet 3D-rekonstruktion, medmindre defokusværdier raffineres for hver partikel uafhængigt i de senere stadier af 3D-rekonstruktionsproceduren. For større partikler (såsom icosahedral virioner eller andre makromolekylære samlinger) kan partikelstørrelsen overstige dybdeskadslen ved høje opløsninger og indføre fasefejl på grund af plan tilnærmelse af Ewald-kuglen i standard 3D-rekonstruktionsalgoritmerne36. Disse fejl kan raffineres af avancerede algoritmer, der allerede er implementeret i almindelige cryo-EM-billedbehandlingspakker 37,28,39. Da Ewald-kuglen har større krumning i 200 kV-data end 300 kV-data, er Ewald-kuglekorrektionen nødvendig ved relativt lavere opløsninger og/eller for relativt mindre makromolekylære enheder, når der anvendes 200 kV TEM’er. På den anden side udviser 200 kV-billeder højere kontrast af partikler i tynd is (20-50 nm), der er betydeligt tyndere end den 200-300 keV elektron gennemsnitlige frie vej (220-280 nm). Den højere kontrast hjælper med at forbedre den korrekte globale justering af individuelle partikler, især for svagt spredende mindre proteiner, hvis struktur endnu ikke er kendt, og 3D-referencemodellen er endnu ikke veletableret.
Her demonstrerede vi på eksemplet med et 20S proteasom, at billedkontrast og kvalitet på samme måde kunne forbedres med et energifilter, når man bruger et 200 kV TEM-mikroskop. Ved hjælp af det samme antal partikler blev data indsamlet ved hjælp af 20 eV-spalten rekonstrueret til 2,26 Å-opløsning sammenlignet med data indsamlet med den fuldt åbnede energispalte, der kun blev rekonstrueret til 2,34 Å-opløsning. Den bedste rekonstruktion blev opnået ud fra data indsamlet ved hjælp af 10 eV-spalten, der blev rekonstrueret til 2,14 Å-opløsning. Disse resultater er i overensstemmelse med den teoretiske forudsigelse om, at filtrering af de uelastisk spredte elektroner øger SNR i indsamlede billeder og letter højere opløsning i cryo-EM-rekonstruktioner fra det givne antal partikler, som opsummeret i tabel 4. Disse resultater blev yderligere bekræftet af B-faktorerne beregnet ud fra disse datasæt, der indikerer højere kvalitet af billeder i de energifiltrerede datasæt.
Vi kan derfor konkludere, at mens 300 kV TEM-mikroskoper leverer den højeste gennemstrømning og den højest mulige opløsning i cryo-EM-rekonstruktioner, leverer 200 kV TEM-mikroskoperne også datasæt af høj kvalitet til kryo-EM-rekonstruktioner i høj opløsning. Vi viste her, at kvaliteten af erhvervede billeder, og dermed den overordnede tid-til-struktur, kan forbedres yderligere ved at bruge 200 kV TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Den præsenterede protokol beskriver alle nødvendige trin til, hvordan man rutinemæssigt opnår kryo-EM-data i høj opløsning ved hjælp af denne opsætning og afslører fine strukturelle detaljer om makromolekylære 3D-strukturer, som er afgørende for at forstå de vigtigste struktur-funktionsforhold i strukturel biologi og strukturbaseret lægemiddeldesign.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |