Laagmicrodissectie van tricuspidalisklepfolders voor biaxiale mechanische karakterisering en microstructurele kwantificering
Summary
Dit protocol beschrijft de biaxiale mechanische karakterisering, gepolariseerde spatial frequency domain imaging-based collageenkwantificering en microdissectie van tricuspidalisklepfolders. De meegeleverde methode verheldert hoe de folderlagen bijdragen aan het holistische foldergedrag.
Abstract
De tricuspidalisklep (TV) regelt de unidirectionele stroom van ongeoxygeneerd bloed van het rechter atrium naar de rechter ventrikel. De tv bestaat uit drie folders, elk met uniek mechanisch gedrag. Deze variaties tussen de drie tv-folders kunnen verder worden begrepen door hun vier anatomische lagen te onderzoeken, namelijk de atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) en ventriculaireis (V). Hoewel deze lagen aanwezig zijn in alle drie de tv-folders, zijn er verschillen in hun diktes en microstructurele bestanddelen die hun respectieve mechanische gedrag verder beïnvloeden.
Dit protocol bevat vier stappen om de laagspecifieke verschillen op te helderen: (i) het mechanische en collageenvezelarchitectuurgedrag van de intacte tv-folder karakteriseren, (ii) de samengestelde lagen (A / S en F / V) van de tv-folder scheiden, (iii) dezelfde karakteriseringen uitvoeren voor de samengestelde lagen en (iv) post-hoc uitvoeren histologische beoordeling. Dit experimentele raamwerk maakt op unieke wijze de directe vergelijking van het intacte tv-weefsel met elk van de samengestelde lagen mogelijk. Hierdoor kan met dit protocol gedetailleerde informatie over de microstructuur en biomechanische functie van de tv-folders worden verzameld. Dergelijke informatie kan mogelijk worden gebruikt om tv-computationele modellen te ontwikkelen die richtlijnen proberen te bieden voor de klinische behandeling van tv-ziekten.
Introduction
De tv bevindt zich tussen het rechter atrium en de rechter ventrikel van het hart. Gedurende de hele hartcyclus reguleert de tv de unidirectionele bloedstroom via het cyclisch openen en sluiten van de tv-anterieure folder (TVAL), de tv-posteriorfolder (TVPL) en de tv-septumfolder (TVSL). Deze blaadjes zijn complex en hebben vier verschillende anatomische lagen – de atrialis (A), de spongiosa (S), de fibrosa (F) en de ventriculaireis (V) – met unieke microstructurele bestanddelen. De elastinevezels in de atrialis en ventriculaireis helpen het weefsel te herstellen naar zijn ongevormde geometrie na mechanische belasting1. De fibrosa bevat daarentegen een dicht netwerk van golvende collageenvezels die bijdragen aan het draagvermogen van de bijsluiters2. Voornamelijk bestaande uit glycosaminoglycanen, is de spongiosa verondersteld om scheren tussen folderlagen mogelijk te maken tijdens hartklepfunctie3. Hoewel alle drie de foldertypen dezelfde anatomische lagen hebben, zijn er variaties in de diktes van de lagen en de samenstellingsverhoudingen die implicaties hebben voor folderspecifiek mechanisch gedrag.
Onderzoekers hebben de eigenschappen van de tv-folders onderzocht met behulp van vlakke mechanische karakteriseringen, histomorfologische beoordelingen en optische karakteriseringen van de collageenvezelarchitectuur. Planaire biaxiale mechanische karakteriseringen proberen bijvoorbeeld fysiologische belasting na te bootsen door loodrechte verplaatsingen op het weefsel toe te passen en de bijbehorende krachten te registreren. De resulterende krachtverplaatsing (of stress-stretch) observaties hebben aangetoond dat alle drie de tv-folders niet-lineair, richtingspecifiek mechanisch gedrag vertonen met meer duidelijke folderspecifieke reacties in de radiale weefselrichting 4,5,6. Aangenomen wordt dat dit folderspecifieke gedrag voortkomt uit verschillen in de microstructurele eigenschappen die worden waargenomen met behulp van standaard histologische technieken 6,7. Verder zijn de tweede harmonische generatie beeldvorming6, small-angle light scattering8 en polarized spatial frequency domain imaging7 (pSFDI) gericht op het begrijpen van deze microstructurele eigenschappen en hebben ze folderspecifieke verschillen aangetoond in de collageenvezeloriëntatie en vezelkrimp die implicaties hebben voor het waargenomen mechanische gedrag op weefselniveau. Deze studies hebben ons begrip van de weefselmicrostructuur en zijn rol in gedrag op weefselniveau aanzienlijk verbeterd. Er moet echter nog veel worden aangepakt bij het experimenteel verbinden van de weefselmechanica en de onderliggende microstructuur.
Onlangs heeft dit laboratorium mechanische karakteriseringen uitgevoerd van de tv-folderlagen gescheiden in twee composietlagen (A / S en F / V) met behulp van een microdissectietechniek9. Dat eerdere werk benadrukte verschillen in de mechanische eigenschappen van de lagen en hielp inzicht te geven in hoe de gelaagde microstructuur bijdraagt aan het mechanische gedrag van het weefsel. Hoewel dit onderzoek ons begrip van de microstructuur van de tv-folder verbeterde, had de techniek verschillende beperkingen. Ten eerste werden de eigenschappen van de samengestelde lagen niet direct vergeleken met het intacte weefsel, wat leidde tot een gebrek aan volledig begrip van de relatie tussen mechanica en microstructuur. Ten tweede werd de collageenvezelarchitectuur van de samengestelde lagen niet onderzocht. Ten derde werden alleen de lagen van de TVAL onderzocht vanwege problemen met het verzamelen van de samengestelde lagen uit de andere twee tv-folders. De hierin beschreven methode biedt een holistisch karakteriseringskader dat deze beperkingen overwint en volledige karakteriseringen van de tv-folders en hun samengestelde lagen biedt.
Dit artikel beschrijft de microdissectietechniek die de drie tv-folders scheidt in hun samengestelde lagen (A / S en F / V) voor biaxiale mechanische en microstructurele karakteriseringen 10,11,12. Dit iteratieve protocol omvat (i) biaxiale mechanische testen en pSFDI-karakterisering van de intacte folder, (ii) een nieuwe en reproduceerbare microdissectietechniek om op betrouwbare wijze de samengestelde tv-lagen te verkrijgen, en (iii) biaxiaal mechanisch testen en pSFDI-karakterisering van de samengestelde tv-lagen. Het weefsel werd blootgesteld aan biaxiale trekbelasting met verschillende krachtverhoudingen voor mechanisch testen. Vervolgens werd pSFDI gebruikt om de oriëntatie en uitlijning van collageenvezels bij verschillende geladen configuraties te bepalen. pSFDI behoudt de native collageenvezelarchitectuur, maakt belastingsafhankelijke analyse mogelijk en omzeilt de typische noodzaak om weefsel te fixeren of te verwijderen voor collageenvezelarchitectuuranalyse, zoals bij beeldvorming van de tweede harmonische generatie of lichtverstrooiing onder een kleine hoek. Ten slotte werden de weefsels bereid met behulp van standaard histologische technieken om de weefselmicrostructuur te visualiseren. Dit iteratieve en holistische raamwerk maakt de directe vergelijking mogelijk van de mechanische en microstructurele eigenschappen van de tv-folder met de samengestelde lagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen voor het protocol zijn: (i) de laagmicrodissectie, (ii) de weefselmontage, (iii) de fiduciale markerplaatsing en (iv) de pSFDI-opstelling. Passende laagmicrodissectie is het belangrijkste en moeilijkste aspect van de hierin beschreven methode. Voordat een onderzoek met behulp van deze techniek wordt gestart, moeten de dissector (en) langdurig oefenen met de microdissectietechniek en alle drie de tv-folders. De dissector moet ervoor zorgen dat de samengestelde laagmonsters voldoende groot zijn (>3,3 mm) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) en de Presbyterian Health Foundation. KMC werd gedeeltelijk ondersteund door het Undergraduate Research Opportunity Program van de University of Oklahoma (OU) en het Honors Research Apprenticeship Program. DWL werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) en de American Heart Association / Children’s Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award # 821298). Al deze steun wordt dankbaar erkend.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
References
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. . An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
