В настоящем протоколе описана пошаговая процедура создания минипиговой модели сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса с использованием сужения нисходящей аорты. Также представлены методы оценки морфологии, гистологии и функции данной модели заболевания.
Более половины случаев сердечной недостаточности (СН) во всем мире классифицируются как сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (СНпФВ). Модели крупных животных ограничены для изучения фундаментальных механизмов СНпФВ и определения потенциальных терапевтических мишеней. В данной работе представлено подробное описание хирургической процедуры сужения нисходящей аорты (DAC) у тибетских минипигов для создания модели HFpEF крупного животного. В этой модели использовалось точно контролируемое сужение нисходящей аорты, чтобы вызвать хроническую перегрузку давлением в левом желудочке. Эхокардиография использовалась для оценки морфологических и функциональных изменений в сердце. После 12 недель нагрузки DAC межжелудочковая перегородка была гипертрофирована, но толщина задней стенки значительно уменьшилась, что сопровождалось расширением левого желудочка. Тем не менее, фракция выброса ЛЖ у модельных сердец поддерживалась на уровне >50% в течение 12-недельного периода. Кроме того, модель DAC показала повреждение сердца, включая фиброз, воспаление и гипертрофию кардиомиоцитов. Уровни маркеров сердечной недостаточности были значительно повышены в группе DAC. Этот ДАК-индуцированный HFpEF у минипигов является мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов этого заболевания и для доклинических испытаний.
Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) составляет более половины случаев сердечной недостаточности и стала проблемой общественного здравоохраненияво всем мире1. Клинические наблюдения выявили несколько критических особенностей СНпФВ: (1) желудочковую диастолическую дисфункцию, сопровождающуюся повышением систолической ригидности, (2) нормальную фракцию выброса в покое с нарушением физической активности и (3) ремоделирование сердца2. Предложенные механизмы включают гормональную дисрегуляцию, системное микрососудистое воспаление, метаболические нарушения и аномалии в белках саркомерного и внеклеточного матрикса3. Однако экспериментальные исследования показали, что сердечная недостаточность со сниженной фракцией выброса (HFrEF) вызывает эти изменения. В клинических исследованиях изучены терапевтические эффекты ингибиторов рецепторов ангиотензина и препаратов для лечения СНрФВ при СНпФВ 4,5. Тем не менее, необходимы уникальные терапевтические подходы к лечению СНпФВ. По сравнению с пониманием клинических симптомов, изменения в патологии, биохимии и молекулярной биологии СНпФВ остаются плохо определенными.
Для изучения механизмов, диагностических маркеров и терапевтических подходов были разработаны животные модели СНпФВ. Лабораторные животные, включая свиней, собак, крыс и мышей, могут развиться СНпФВ, и в качестве факторов индукции были выбраны различные факторы риска, включая артериальную гипертензию, сахарный диабет и старение. Например, дезоксикортикостерона ацетат в отдельности или в сочетании с диетой с высоким содержанием жиров/сахара индуцирует СНпФВ у свиней 8,9. Перегрузка желудочковым давлением является еще одним методом, используемым для развития СНпФВ на моделях крупных и мелких животных10. Кроме того, в последние годы на разных континентах были приняты конкретные пороговые значения ФВ для определения СНпФВ, как видно из рекомендаций Европейского общества кардиологов, Фонда Американского колледжа кардиологов/Американской кардиологической ассоциации11, Японского общества кровообращения/Японского общества сердечной недостаточности12. Таким образом, многие ранее созданные модели могут стать подходящими для исследований СНпФВ, если будут приняты клинические критерии. Например, Youselfi et al. утверждали, что генетически модифицированная линия мышей Col4a3-/-, является эффективной моделью HFpEF. У этого штамма развились типичные сердечные симптомы HFpEF, такие как диастолическая дисфункция, митохондриальная дисфункция и ремоделирование сердца13. В предыдущем исследовании использовалась высокоэнергетическая диета для индуцирования сердечного ремоделирования со средним диапазоном ФВ у пожилых обезьян14, характеризующегося нарушением обмена веществ, фиброзом и снижением актомиозина MgATPase в миокарде. Поперечное сужение аорты у мышей (TAC) является одной из наиболее широко используемых моделей для имитации гипертоничевидной кардиомиопатии. Левый желудочек прогрессирует от концентрической гипертрофии с повышением ФВ до расширенного ремоделирования со снижением ФВ15,16. Переходные фенотипы между этими двумя типичными стадиями позволяют предположить, что техника сужения аорты может быть использована для изучения СНпФВ.
Патологические особенности, клеточная сигнализация и профили мРНК модели HFpEF свиньи были опубликованы ранее17. Здесь представлен пошаговый протокол создания этой модели и подходы к оценке фенотипов этой модели. Процедура проиллюстрирована на рисунке 1. Вкратце, план операции был составлен совместно главным исследователем, хирургами, лаборантами и персоналом по уходу за животными. Минипиги прошли медицинское обследование, включая биохимические анализы и эхокардиографию. После операции были проведены противовоспалительные и обезболивающие процедуры. Для оценки фенотипов использовали эхокардиографию, гистологическое исследование и биомаркеры.
В этом исследовании использовались методы DAC для разработки модели HFpEF для тибетских минипигов. Здесь представлен пошаговый протокол подготовки животных и инструментов, включая седацию, интубацию трахеи, канюляцию вен, хирургическое вмешательство и послеоперационный уход. Также пред?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Гуандунской научно-технической программой (2008A08003, 2016A020216019, 2019A030317014), Гуанчжоуской научно-технической программой (201804010206), Национальным фондом естественных наук Китая (31672376, 81941002) и Ключевой лабораторией лабораторных животных провинции Гуандун (2017B030314171).
Absorbable surgical suture | Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China | 4-0 | |
Aesthesia ventilator station | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China | WATO EX-35vet | |
Aspirator | Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China | YX930D | |
Benzylpenicillin | Sichuan Pharmaceutical. INC, China | H5021738 | |
Disposal endotracheal tube with cuff | Shenzhen Verybio Co., Ltd, China | 20 cm, ID 0.9 | |
Disposal transducer | Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China | ||
Dissection blade | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | ||
Electrocautery | Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | GD350-B | |
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit | Cusabio Biotech Co., Ltd, China | CSB-E08594r | |
Eosin | Sigma-Aldrich Corp. | E4009 | |
Flunixin meglumine | Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2012)-090242103 | |
Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
Hematoxylin | Sigma-Aldrich Corp. | H3136 | |
Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd, China | Veteasy for animals | |
Laryngoscope | Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China | For adults | |
LED surgical lights | Mingtai Medical Group, China | ZF700 | |
Microplate reader | Thermo Fisher Scientific, USA | Multiskan FC | |
Microscope | Leica, Germany | DM2500 | |
Mobile restraint unit | Customized | N/A | A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover |
Oxygen | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich Corp. | V900894 | |
Patient monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | Beneview T5 | |
Peripheral Intravenous (IV) Catheter | Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China | 26G X 16 mm | |
Propofol | Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd. | H20051842 | |
Rib retractor | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
Ruler | Deli Manufacturing Company, China | ||
Scalpel handles | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
Scissors (g) | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
Suture | Medtronic-Coviden Corp. | 3-0, 4-0 | |
Ultrasonic gel | Tianjin Xiyuansi Production Institute, China | TM-100 | |
Veterinary monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | ePM12M Vet | |
Veterinary ultrasound system | Esatoe, Italy | MyLab30 | Equiped with phased array transducer (3-8 Hz) |
Xylazine hydrochloride injection | Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2016)-07003 | |
Zoletil injection | Virbac, France | Zoletil 50 | Tiletamine and zolazepam for injection |