Detta arbete beskriver utvecklingen av flexibla interdigiterade elektroder för implementering i 3D-hjärntumörmodeller, nämligen in vitro-odling, in ovo-modell och in vivo murin modell. Den föreslagna metoden kan användas för att utvärdera effekterna av pulserande elektriska fält på tumörer vid olika nivåer av komplexitet.
Glioblastom är svårt att utrota med vanliga onkologibehandlingar på grund av dess höga grad av invasivitet. Bioelektriska behandlingar baserade på pulserande elektriska fält (PEF) är lovande för att förbättra behandlingseffektiviteten. De är dock beroende av styva elektroder som orsakar akut och kronisk skada, särskilt i mjuka vävnader som hjärnan. I detta arbete användes flexibel elektronik för att leverera SUF till tumörer och det biologiska svaret utvärderades med fluorescerande mikroskopi. Interdigiterade guldelektroder på ett tunt, transparent parylen-C-substrat belades med den ledande polymeren PEDOT: PSS, vilket resulterade i en formbar och biokompatibel enhet. Effekterna av SUF på tumörer och deras mikromiljö undersöktes med hjälp av olika biologiska modeller. Först odlades monolager av glioblastomceller ovanpå elektroderna för att undersöka fenomen in vitro. Som ett mellansteg utvecklades en in ovo-modell där konstruerade tumörsfäroider ympades i det embryonala membranet hos en vaktel. På grund av frånvaron av ett immunförsvar ledde detta till mycket vaskulariserade tumörer. I detta tidiga utvecklingsstadium har embryon inget immunförsvar, och tumörer erkänns inte som främmande kroppar. Således kan de utvecklas snabbt samtidigt som de utvecklar sina egna kärl från det befintliga embryokärlsystemet, vilket representerar en värdefull 3D-cancermodell. Slutligen utvärderades flexibel elektrodtillförsel av SUF:er i en komplett organism med ett funktionellt immunsystem, med hjälp av en syngen, ortograft (intrakraniell) musmodell. Tumörsfäroider ympades in i hjärnan hos transgena multifluorescerande möss före implantation av flexibla organiska elektrodanordningar. Ett förseglat kranialfönster möjliggjorde multifotonavbildning av tumören och dess mikromiljö under behandling med SUF under flera veckors tid.
Glioblastoma multiforme (GBM) är en mycket invasiv tumör och därför svår att utrota med standardbehandlingar som resektion, strålbehandling och kemoterapi. Trots multimodala behandlingar är prognosen fortfarande mycket dålig och de flesta av patienterna upplever sjukdomsprogression inom 1 år efter diagnos 1,2. Nyligen har utvecklingen av bioelektriska behandlingar visat stor potential att förbättra befintliga terapier. Dessa terapier använder leverans av pulserade elektriska fält (PEF), vanligtvis i en enda behandlingssession, för att störa cellmembranintegriteten och mikromiljön hos tumörer. Denna cellmembranstörning, även känd som elektroporering, kan vara reversibel eller irreversibel beroende på den elektriska fältintensiteten och antalet pulser. Irreversibel elektroporering (IRE) tillämpas som en icke-termisk vävnadsablationsteknik där elektriska pulser orsakar dödlig skada på cellmembran som leder till celldöd3. Reversibel elektroporering tillämpas i elektrokemoterapi (ECT), en etablerad teknik som består av tillförsel av SUF i kombination med kemoterapiläkemedel för att förbättra läkemedelsupptaget i cancerceller4. Dessutom visade nyligen genomförda studier kalciumelektroporering som ett alternativ till ECT med hög effektivitet för cancerbehandling, vilket också är billigt och inducerar färre biverkningar5. Trots dessa lovande framsteg används PEF i allmänhet med hjälp av styva metallelektroder som är kända för att skada mjukvävnad6. Hjärnan är särskilt känslig för sådana invasiva enheter där den mekaniska obalansen inducerar inflammation och astroglial ärrbildning7.
I detta sammanhang presenteras ett flexibelt PEF-leveranssystem i kombination med 3D-modeller av glioblastomtumörer, från mikrofabrikation till en murin modell. Konforma elektroder tillverkas med vanliga tunnfilmsmikrofabrikationsprocesser, inklusive användning av mjuka och biokompatibla material såsom parylen-C, guld och PEDOT: PSS 8,9. En interdigiterad elektroddesign används för att täcka en stor yta samtidigt som tillräcklig transparens bibehålls för avbildning mellan elektrodfingrarna10. För tumörmodellen produceras 3D-sfäroider av glioblastomceller som uttrycker en genetiskt kodad fluorescensreporter med användning av en variant av vätskeöverläggets 96-brunnsplattmetod11. Sfäroiderna ympas in i korioallantoiska membranet hos ett vaktelembryo, vilket resulterar i en in ovo-modell som i stor utsträckning har använts för att studera angiogenes eller läkemedelstoxikologi12,13. Tumörer kan ympas och vaskulariseras av embryots vaskulatur i frånvaro av ett immunsystem vid detta stadium av embryonal utveckling12. Flexibla elektroder placeras sedan ovanpå den vaskulariserade tumören för att studera effekten av PEF-leverans på sfäroiden och dess vaskulatur. Slutligen undersöks dessa effekter på en komplett levande organism, inklusive tumörmikromiljö och immunsystem, genom att implantera konstruerade sfäroider i hjärnparenkymet hos murina modeller14. Flexibla elektroder placeras ovanpå införingsstället och kraniotomin förseglas med ett glasfönster, vilket möjliggör upprepad tvåfotonavbildning under flera veckor.
Dessa metoder kommer att vara användbara för personer som är intresserade av olika domäner, allt från mikroelektronikteknik till onkologiapplikationer. Mikrofabrikationsprotokollet kan användas och anpassas för alla applikationer som kräver tunnfilmsmetallelektroder belagda med PEDOT:PSS. Vidare kommer de biologiska modeller som utvecklats för utvärdering av antitumörbehandling att vara av allmänt intresse för undersökningen av differentieringen av cellulärt, vaskulärt och immunsvar mot implanterade material.
Tillvägagångssättet som beskrivs i detta arbete gör det möjligt för hjärntumörmodeller med ett integrerat PEF-leveranssystem att studera effekten av SUF på olika nivåer av biologisk organisation. Mikrofabrikationsprotokollet består av standardtunnfilmsprocesser, som ger en stor grad av frihet i elektroddesign som kan anpassas till den specifika applikationen. Ibland kan ett ytterligare termiskt glödgningssteg vara användbart i slutet av tillverkningen för att minska böjningen av elektroderna som inträffade under tillverkningen.
Användningen av en stabil glioblastomcellinje som uttrycker en fluorescerande kalciumindikator undviker alla komplikationer i samband med färgleverans och retention, särskilt i 3D-tumörer som är mycket täta16. Faktum är att en hög uttrycksnivå observeras under en lång period jämfört med vanliga kemiska fluorescerande kalciumindikatorer17. Detta protokoll kan tillämpas på olika cellinjer, eftersom det vanligtvis används för att avbilda neural aktivitet11. Här användes humana och murina cellinjer (U87 och Gl261 för implantation i immunbristfälliga respektive immunkompetenta möss). Faktum är att nyligen genomförda studier visade att U87-cellinjen skiljer sig från de ursprungliga cellerna eftersom många mutationer förvärvades under år av cellodling, vilket påverkar experimentell reproducerbarhet18. Metoden som används för framställning av 3D-tumörer är hög genomströmning, reproducerbar och möjliggör generering av sfäroider av en specifik storlek beroende på cellinjen, antalet celler vid sådd och tillväxttiden19. Dessa sfäroider är emellertid täta, vilket ger en nackdel vid avbildning vid tumörens kärna.
In ovo-modellen är användbar som ett första tillvägagångssätt för att studera effekten av PEF på 3D-tumörer och deras vaskulatur, utan interaktioner med andra celltyper som finns i hjärnan. Denna modell är billig, snabb, hög genomströmning och väcker färre etiska problem än djurmodeller. Det är viktigt att bibehålla embryonets integritet under hela experimentet, eftersom det kan påverka dess överlevnad och kvaliteten på avbildningen. Särskild försiktighet måste vidtas när vaktelägget öppnas för att undvika skador på det embryonala membranet. Transplantatet och placeringen av de flexibla elektroderna måste också utföras noggrant för att undvika blödning som kan döda embryot. Injektion av fluorescerande färgämne i blodkärlen möjliggör samtidig visualisering av tumörcellerna och vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulära injektionen måste utföras försiktigt för att undvika att färgämne läcker in i den embryonala vätskan, vilket kan orsaka en kvarvarande fluorescens i bakgrunden som försämrar bildkvaliteten. Denna modell kan också användas för att följa läkemedelsupptag, eftersom den ger tillgång till cirkulationssystemet. Experimenten begränsas emellertid av embryots 12-dagars överlevnadstid, vilket möjliggör 7 dagars observation, vilket är betydligt kortare än in vivo-modellen 21.
In vivo-hjärntumörmodellen kan övervakas i 4 till 5 veckor innan djuren når ett etiskt experimentellt effektmått som bestäms av en plötslig viktminskning på 20 %. Det tolereras väl och förblir på plats om elektrodens anslutande svans inte är för lång. Annars tenderar djur att repa vändkontakten, som i slutändan kan rivas, vilket förhindrar efterföljande anslutning till stimulatorn. Denna 4-veckorsperiod är ändå värdefull för att täcka de olika stadierna av glioblastomutveckling. Vid jämförelse av tumörcelldensiteterna i samma volym av intresse vid olika tidsintervall kan utvecklingen av tumörtillväxtkinetiken observeras. I synnerhet observerades förbättrad tumörtillväxt vid tidpunkten för immunomkopplaren22. En liknande studie i närvaro av en stimulerande elektrod skulle informera om effekten av PEF på tumörproliferationshastighet och tumörkänslighet för immuneliminering. I jämförelse med in ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en värdefull preklinisk modell för att studera immuncellers påverkan på tumörprogression och deras bidrag till den terapeutiska effekten av PEF. Detta protokoll är anpassat från en tidigare artikel med tillsats av en flexibel elektrodanordning på tumören innan ett kranialfönster14 placeras. Både akuta och kroniska bioelektriska behandlingar av tumörer kan karakteriseras av direkta och efterföljande observationer med tvåfotonmikroskopi givet att initial stimulering förväntas inducera celldöd och utlösa varaktig dysreglering av immunsvaret.
Anslutningarna till den flexibla sonden är lättillgängliga under tvåfotonmikroskopet. Elektriska stimuleringsparametrar kan således justeras i realtid baserat på den observerade effekten på nervvävnaden och / eller de riktade cellerna, liknande hur en läkare skulle utföra interventionella procedurer medan han observerade MR- eller CT-bilder av sin patient. En sista övervägande är vikten av noggrann tätning av elektroden på hjärnan med superlim och silikonlim för att förhindra vävnadsåterväxt.
Sammanfattningsvis representerar protokollet som beskrivs här en innovativ modell för att studera effekten av PEF-terapi med flexibla organiska polymerelektroder för glioblastomtumörmodeller. De två modellerna uppvisar olika nivåer av komplexitet så att cellulära, vaskulära eller immuneffekter kan separeras för en bättre förståelse av verkningsmekanismerna. Konformella, ytliga elektroder minskar den iatrogena skadan samtidigt som de möjliggör störning av tumörmikromiljön, vilket utlöser vasokonstriktion eller dysregulering av intracellulärt kalcium15.
The authors have nothing to disclose.
Det arbete som redovisas här stöddes av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-18-CE19-0029). Författarna tackar varmt S.M. Bardet för hennes bidrag till genereringen av en stabil GCaMP6f-cellinje och D. O’Connor för hennes hjälp med in ovo-modellen .
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
96-well plate | Falcon | 353075 | |
Acetone | Technic | 530 | |
Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
agarose | Sigma | A9539 | |
autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
Buprenorphine | Axience | ||
Carprofen | Rimadyl | ||
Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
Flask | Greiner | 658170 | |
Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
Gold pellets – Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
Kapton tape SCOTCH 92 33×19 | 3M | Polyimide protection tape | |
Lab made pulse generator | |||
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
Plastic mask | Selba | ||
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
Propan-2-ol | Technic | 574 | |
Protolaser S | LPKF | ||
puromycin | Gibco | A11103 | |
Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
Scepter Sensors – 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
spin coater | Süss Microtec | ||
Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
Super glue | Office depot | ||
tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |