Summary
표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.
Abstract
말라리아는 전 세계적으로 가장 파괴적인 질병 중 하나로 남아 있으며 현재까지 아프리카 지역은 여전히 전 세계 모든 사례의 94%를 차지하고 있습니다. 이 기생충 질병에는 원생 동물 기생충, Anopheles 모기 벡터 및 척추 동물 숙주가 필요합니다. Anopheles 속은 500 종 이상으로 구성되며 그 중 60 종은 기생충의 벡터로 알려져 있습니다. Plasmodium 기생충 속은 250 종으로 구성되며이 중 48 종은 질병 전파에 관여합니다. 또한, Plasmodium falciparum 기생충은 최근 몇 년 동안 사하라 사막 이남의 아프리카에서 말라리아 사례의 약 99.7 %에 기여했습니다.
배우자 세포는 기생충의 성기의 일부를 형성하며 감염된 인간 숙주를 먹일 때 암컷 모기에 의해 섭취됩니다. 모기 내 기생충의 추가 발달은 모기의 중추에있는 유리한 환경 조건에 의해 향상됩니다. 여기에서 암컷과 수컷 배우자의 융합이 일어나고 운동성 ookinetes가 시작됩니다. ookinetes는 모기의 중추 상피에 들어가고, 성숙한 ookinetes는 oocysts를 형성하고, 차례로 운동성 포자 소체를 생성합니다. 이 포자소체는 모기의 침샘으로 이동하여 모기가 혈액 식사를 할 때 주입됩니다.
약물 발견 목적을 위해, 모기는 표준 막 공급 분석 (SMFA)에서 배우자 세포에 감염된 혈액에 인위적으로 감염되었다. 모기 내 감염을 감지하고 / 또는 항 말라리아 화합물의 효능을 평가하기 위해 암컷 모기의 중추를 감염 후 제거하고 수주로 염색했습니다. 이 방법은 난포 유병률과 강도를 정확하게 결정하기 위해 현미경으로 난포낭의 시각적 검출을 향상시키는 데 사용되었습니다.
Introduction
전 세계적으로 가장 파괴적인 질병 중 하나로 알려진 말라리아는 여전히 여러 국가, 특히 아프리카 지역 내 국가에 큰 위협이 되고있으며 전 세계 사례의 약 95%에 기여합니다1. 이 질병은 원생 동물 기생충에 의해 발생하며 Anopheles 모기 벡터와 함께 이러한 범인은 인간 숙주2에 큰 해를 끼칠 수 있습니다. 보다 구체적으로, Plasmodium 기생충 속의 falciparum 종은 사하라 사막 이남의 아프리카1에서 말라리아 사례의 약 99 %를 차지합니다. 이 외에도 몇 가지 주요 Anopheles 모기 벡터 (An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. 및 An. funestus Giles 포함)는 전 세계적으로 기생충 전파의 95 % 이상을 차지할 수 있습니다 3,4,5,6,7,8 . 이상적인 기생충-벡터 교제를 확립하기 위해서는 모기 벡터가 기생충에 감염되기 쉽고 전염시킬 수 있어야 합니다9. 또한, 벡터와 기생충 모두 완벽한 감염 조합을 형성하기 위해 물리적 장벽을 극복해야 한다 - 모기 벡터는 기생충 발달을 유지할 수 있어야 하고, 기생충은 숙주의 방어 기작을 극복할 수 있는 능력을 가져야 한다10,11.
P. falciparum 기생충의 성기 인 배우자 세포는 벡터와 기생충 파트너를 연결하는 데 중요한 역할을합니다12. 성적 발달은 생체 내에서 일어나며, 배우자 세포 생성은 성숙한 배우자 세포가 운동성 남성 마이크로 배우자와 여성 거대 배우자13으로 분화하는 과정을 설명합니다. 모기 내에서 일어나는 또 다른 과정은 각질화(exflagellation)인데, 이 과정에서 수컷 배우자 세포가 배우자로 변형되어 혈액 식사11 동안 흡수된 적혈구로부터 나온다. 편모 과정은 모기 중추14의 환경에서의 유리한 변화에 의해 강화되는 것으로 추가로 제안된다. 각질 편각 후, 접합체는 수컷과 암컷 배우자13의 융합에 의해 형성된다. 접합체에서 운동성 ookinete가 발생하여 혈액 식사에서 모기 중추13의 상피로 이동합니다. 여기에서 ookinete가 성숙하고 oocyst가 형성되어 운동성 포자 소체13,15를 생성합니다. 그런 다음 포자소체는 모기 타액선으로 이동하고 모기가 숙주로부터 혈액 식사를 할 때 이러한 포자소체가 숙주의 혈류(15)에 주입됩니다.
벡터 제어 전략과 효과적인 항 말라리아 약물의 사용을 결합한 말라리아 통제 중재는이 질병을 퇴치하는 데 중요해졌습니다15. 기생충과 모기 저항성이 증가함에 따라 새로운 항 말라리아 화합물의 식별에 대한 시급성이 증가하고 있습니다16. 따라서, 투과 차단 화합물의 생체 내 평가가 중요하다16. 이러한 효과적인 전염 차단 약물의 개발 후, SMFA는 이러한 화합물이 Anopheles 모기17,18,19에서 P. falciparum의 성 발달을 억제하는지 여부를 평가하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 1970-1980년대부터 전송 차단20,21을 평가하기 위한 황금 표준으로 인정을 받았습니다. 이 분석은 특수 장비가 필요한 RT-qPCR과 같은 다른 분석보다 저렴한 대안을 제공합니다. 또한 실험을 수행하는 데 환자가 필요하지 않습니다. 이 분석은 또한 암컷 모기에 배우자 세포 유도 혈액을 제공하는 것을 포함하며, 그런 다음 난포 발달이 존재하는지 여부를 평가하기 위해 해부됩니다21. 이것은 배우자 세포 정량화 및 화합물22 때문에 변형 된 oocysts의 검출을 허용합니다. 화합물이 효과적인 것으로 분류되기 위해서는 감염 억제17,21,22를 평가하기 위해 유병률(중추에 적어도 하나의 난포가 있는 모기의 비율)과 모기 중추의 난포낭 수(강도)를 평가해야 합니다.
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Protocol
프로토콜에 대한 설명은 그림 1 을 참조하십시오. 프리토리아 대학 보건 과학 윤리위원회 (506/2018)로부터 인간 혈액의 회수 및 사용에 대한 윤리적 허가를 받았습니다.
1. 배우자 세포 배양
참고: SMFA를 설정하기 전에 프리토리아 대학에서 배우자 세포 배양을 준비했습니다(전체 프로토콜은 Reader et al.22 참조).
- NF54 기생충 균주로부터의 V 기 배우자 세포로 구성된 배우자 세포 배양을 준비하십시오.
- 배양의 배우자 세포 혈증이 1.5 %에서 2.5 % 사이인지 확인하고 신선한 적혈구가 첨가 된 A + 남성 혈청에 50 % 헤마토크릿이 있는지 확인하십시오.
- 배양물을 상이한 플라스크로 분리하고, SMFA를 실시하기 48시간 전에 각각의 처리에 대해 2μM의 각각의 화합물을 첨가한다. 대조군을 치료하지 않고 그대로 두십시오.
- SMFA를 수행하기 직전에 배우자 세포 배양을 평가하여 3 : 1 여성 : 남성 비율의 존재로 남성 배우자의 편모를 보장합니다.
2. SMFA를 통한 모기의 인공 감염
알림: 생물 안전성 : 감염된 모기는 접근이 제한된 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 시설에 보관해야합니다.
- 구강 흡인기를 사용하여 먹이를 주지 않은 암컷 An. gambiae 모기 25마리를 350mL 먹이 컵에 넣습니다. 각 치료 컵에 대해 동일한 작업을 수행하고 대조군으로 사용할지 치료 그룹으로 사용할지에 따라 컵에 명확하게 라벨을 붙입니다. 포함된 기술 복제물의 수에 따라 처리당 컵 수를 선택합니다.
참고: 5일에서 7일 사이의 집락 모기는 일반적인 전파 차단 화합물 평가에 사용됩니다. 혈액 공급 전에 3-4 시간 이상 굶주린 모기는 SMFA 기간 동안 혈액 섭취를 촉진합니다. - 유리 피더 시스템을 수조에 연결하고 온도를 37 ° C로 유지하십시오.
주: 유리 공급기는 수조가 연결된 실리콘 튜브에 연결된 두 개의 암으로 구성됩니다(그림 2). 피더의 중공 구조는 물이 순환하고 혈액 온도를 유지할 수있게합니다. - 젖소 장 (또는 합성막)을 수돗물로 헹구어 준비하고 각 피더에 맞는 조각으로 자릅니다. 각 피더를 덮고 탄성 밴드로 멤브레인을 고정하십시오.
참고: 장에 대한 윤리적 허가는 필요하지 않았습니다., 음식 준비를 위해 대중에게 판매되는 지역 정육점에서 구입했기 때문입니다. - 감염 컵을 피더 아래에 놓고 멤브레인을 컵 그물 위에 놓습니다.
- 배우자 세포에 감염된 혈액 1mL를 대조군 컵의 피더에 추가하고 배우자 세포에 감염된 혈액을 각 해당 화합물 피더와 컵에 화합물을 첨가합니다.
- 모이통을 덮지 않은 상태에서 모기를 약 40분 동안 먹이도록 두십시오.
알림: 먹이는 어둠 속에서 곤충 조건 (25 ° C, 80 % 상대 습도)에서 이루어집니다. 피더의 직경은 약 13mm입니다. - 수유 후 컵에서 피더를 제거하고 피더를 헹구고 과도한 혈액을 차아 염소산염으로 처리하십시오.
- 모든 모기를 얼음 위에 쓰러 뜨리고 (1-2 분 동안) 먹이를주지 않은 모기를 혈액 식사를 한 모기와 분리하여 컵에서 먹이지 않은 모기를 제거하십시오. 먹이를 먹고 완전히 충혈 된 모기와 먹이를주지 않은 모기를 구별하기 위해 부어 오르고 붉은 복부 (혈액을 나타냄)를 찾으십시오 (그림 3).
- 감염 컵을 생물 안전 챔버 (보충 그림 S1)에 놓고 각 컵에 10 % 설탕 물 패드를 제공하여 8-10 일 동안 격일로 설탕물을 교체합니다.
3. 감염된 모기의 준비
알림: 프로토콜의 이 부분은 BSL2 감염실 내에서 이루어집니다. 승인되고 훈련된 직원만 감염된 모기가 있는 감염실에 들어갈 수 있습니다. 모기는 입구 지점이 하나만 포함 된 수정 된 컵에 보관되며 구강 흡인기가 제거되면 자동으로 밀봉됩니다. 이 컵은 탈출을 방지하기 위해 투명한 열가소성 용기 안에 넣습니다. 컨테이너는 이중 도어 시스템 뒤의 감염실에 있습니다. 감염된 모기에 우발적으로 노출되는 데 필요한 모든 프로토콜이 마련되어 있어야 합니다(보충 파일 S1). 프로토콜은 국가별로 다르며 기관의 요구 사항에 따라 다릅니다.
- 감염 후 8-10 일에 감염된 모기를 얼음 위에 놓고 70 % 에탄올이 함유 된 라벨이 붙은 튜브로 옮겨 쓰러 뜨립니다 (각 대조군과 치료 그룹의 모기를 별도로 유지).
- 감염실을 떠나기 전에 모든 모기가 죽었는지 확인하십시오.
4. 감염된 모기의 해부
참고 : 프로토콜의이 부분은 실험실에서 수행됩니다.
- 모기를 여과지가 늘어선 라벨이 붙은 페트리 접시로 옮기고 대조군과 시험군을 분리합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS) 방울을 현미경 슬라이드(대조군/테스트 그룹에 따라 표시)에 놓고 개별 모기를 여과지에서 PBS로 옮깁니다.
- 집게로 7번째 복부 부분을 당기면서 해부 바늘로 모기의 흉부를 고정하여 고정되고 감염된 검체에서 중추를 제거합니다.
- 장이 노출되고 보이는 상태에서 장과 난소를 구별하기 위해 Malpighian 세뇨관 (그림 4A, B)을 찾으십시오. PBS에서 제거하고 새 현미경 슬라이드에서 0.1% 수크로크롬 방울로 옮기고 장을 8-10분 동안 염색되도록 둡니다.
- 염색 후 염색된 내장에 커버슬립을 놓고 명시야 조명 아래에서 20x-40x 배율로 장을 봅니다(그림 4C, D).
- 각 대조군 및 치료 그룹에 대한 중추 당 oocyst의 존재와 수를 기록합니다 (보충 파일 S2).
- 방정식 (1)을 사용하여 전송 차단 활동을 계산합니다.
%미정
(1)
여기서 TBA = 전염 차단 활성 (난포 유병률 감소); p = 난포낭 유병률; C = 대조군; T = 치료. - 방정식 (2)를 사용하여 전송 감소 활성을 계산하십시오.
%TRA =
(2)
여기서 TRA = 전염 감소 활성 (난포 강도의 감소); I = 난포낭 강도; C = 대조군; T = 치료.
참고: TBA는 크게 감소하지 않을 수 있지만 TRA에서 상당한 차이가 관찰될 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이는 평가되는 화학 물질에 따라 다릅니다. - 비모수 t-검정( Mann-Whitney)을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
(1)
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Representative Results
해부된 대조군 표본의 총 수는 47개였으며, 평균 유병률은 89%였으며 중추당 난포의 강도는 9.5개였습니다(표 1, 이전에 발표된22개). 화합물 MMV1581558의 경우 샘플 크기는 총 42 개의 표본에 도달했으며 난포 유병률은 36 %이고 평균 강도는 1.5 oocysts입니다. 이것은 세 가지 생물학적 복제 모두에서 58%의 난포 유병률과 82%의 TRA 감소를 보여줍니다(표 1).
MMV1581558의 %TRA 및 %TBA는 모두 50% 이상이었습니다. 따라서이 화합물은 전송 차단 및 감소의 잠재적 후보로 간주 될 수 있습니다. 강도 및 유병률 모두에 대한 통계학적 분석은 대조군과 MMV1581558 (p <0.0001) 사이에 유의한 차이를 보였다(표 1 및 도 5).
그림 1: Plasmodium falciparum 배우자 세포가 있는 Anopheles 모기의 인공 감염 시스템의 그림. 약어 : SMFA = 표준 막 공급 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배우자세포 배양의 온도를 조절하기 위해 유리 피더와 실리콘 튜브를 통해 순환하는 물이 있는 막 공급 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈액 식사 후 완전히 충혈된 Anopheles 암컷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 아노펠레스 암컷의 중추. (a) 말피기안 세뇨관; (b) 난소; (c) 플라스모듐 팔시파룸 난포스트; (D) 감염되지 않은 중추. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대조군(n=47)과 화합물 MMV1581558(n=42) 사이의 난포낭 강도의 통계적 요약. 오차 막대, ±SE; 별표는 상당한 차이를 나타냅니다(ns P > 0.05, ****P < 0.0001). 약어 : DMSO = 디메틸 설폭 사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 반복 횟수. | 표본 크기 | 평균 보급 | 평균 강도/내장 | %미정 | %TRA | p-값 유병률 | p-값 강도 |
| 제어 | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0.0001 | <0.0001 |
표 1: 표준 막 공급 분석의 세 가지 생물학적 복제 중에 평가된 항말라리아 화합물 MMV1581558의 데이터 세트. 각 대조군과 시험군에 대해 평균 난포충 유병률 및 중추당 강도와 함께 표본 크기(n)가 표시됩니다. 전송 차단 활동 및 전송 감소 활동이 표시됩니다. 약어 : TBA = 전송 차단 활동; TRA = 전송 감소 활성.
보충 그림 S1 : 곤충의 감염실에있는 챔버 내에 포함 된 감염된 모기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S1 : 감염된 모기에 우발적 인 노출을위한 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S2: 난포종 유병률 및 강도에 대한 기록 시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜이 성공적으로 실행되려면 지루하고 힘든 프로세스일지라도 각 단계에 주의를 기울여야 합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 SMFA23,24를 시작하기 전에 배우자 세포 배양의 품질이 양호하고 올바른 남성 : 여성 비율을 가진 성숙한 배우자 세포로 구성되어 있는지 확인하는 것입니다. SMFA 기간 동안 수컷 배우자가 모기에 들어가기 전에 각색이 생기는 것을 방지하기 위해 배우자 세포 배양을 올바른 온도로 유지하는 것도 중요합니다. 성공적인 인공 감염을 확립하는 데 중요한 역할을하는 또 다른 요소는 모기의 섭식 행동이 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 암컷 모기가 혈액 식사를 열망하도록하는 것입니다25. oocysts가 발달 한 후에 완전히 먹이를 먹인 모기 만 해부되도록하려면 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 각 컵에서 먹이지 않은 모든 모기를 제거하는 데 집중하는 것이 중요합니다. 중추 해부는 추가 분석을 위해 충분한 표본을 사용할 수 있도록 하는 또 다른 중요한 단계입니다. 중추는 찢어지는 경향이 있어 중추의 내용물이 흘러나올 수 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 현미경으로 oocysts의 검출 및 계수에 중요한 중추의 염색입니다.
상기 방법의 일부 한계는 TRA 추정(20,26)의 정확도 및 분산에 영향을 미칠 수 있는 모기의 작은 표본 크기를 포함한다. 이것은 대부분 SMFA 기간 동안 낮은 공급 속도의 결과입니다. 대부분의 모기 군집은 동물의 혈액에서 유지되기 때문에 SMFA에서 배우자 세포에 감염된 인간 혈액 배양을 제공하면 최적이 아닌 먹이 속도에 기여할 수 있습니다. 이것은 또한 모기에 대한 방충제 역할을 할 수있는 특정 화합물의 첨가로 관찰됩니다. 수수로 oocysts를 염색하는 것은 중추27 내의 다른 구조를 염색하기 때문에 몇 가지 단점이 있습니다. 이로 인해 oocysts의 가시성이 떨어지고 oocysts 계산이 어려워 결과에 영향을 미칩니다28. SFMA 분석의 결과를 대체 분석29,30과 비교할 때도 상충되는 결과가 발생합니다. 더욱이, 시간 제약 및 노동 집약적 해부와 같은 한계는 이 방법(31)을 사용할 때 고처리량 처리를 제한한다. 이 인공 감염 과정에서 모기가 섭취 한 배우자 세포의 수도 경우에 따라 낮아 oocyst 강도32,33,34에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다.
생물발광 분석을 포함하는 다른 대안적인 방법들이 또한 개발되었으며, 여기서 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하는 기생충 라인이 사용된다36. 후자의 방법이 샘플의 처리량을 증가시키지만, 이러한 기생충 라인은 자연적으로 발생하거나 야생형 기생충을 수반하는 감염의 전파를 평가하는데 사용될 수 없기 때문에 자체 제한도 갖는다(37). 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 다른 방법도 널리 사용됩니다. 이러한 방법이 난포 검출의 민감도를 향상 시키지만 모든 방법이 완전히 정량적인 것은 아닙니다 38,39,40. TaqMan qPCR 분석은 P. falciparum oocysts의 검출을 위한 또 다른 유망한 방법이며, 이 방법은 현미경 41,42,43,44보다 훨씬 낮은 수준의 기생충혈증을 정량화하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 이 분석에는 값비싼 장비와 프로브가 필요합니다. 또한, 화합물로 인한 난포 형태의 가능한 변화는 qPCR 동안 눈에 띄게 검출 될 수 없다. 이러한 방법과 비교할 때 SFMA 방법은 이 방법의 대부분의 한계를 비교적 쉽게 극복할 수 있기 때문에 감염 검출 및 화합물 평가에 유용한 도구로 남아 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 인정하고 싶습니다교수. Lyn-Mari Birkholtz와 프리토리아 대학의 지속 가능한 말라리아 통제 연구소 생화학, 유전학 및 미생물학과의 Janette Reader 박사는 배우자 세포 배양을 배양하고 공급합니다. 기생충 균주는 후자의 부서 (이 간행물의 일부가 아님)에서 얻었습니다. 과학 혁신부 (DSI) 및 국립 연구 재단 (NRF); 남아프리카 연구 의자 이니셔티브 (UID 64763에서 LK 및 UID 84627에서 LMB); NRF 실무 공동체 (UID 110666 LMB 및 LK로); 남아프리카 의학 연구위원회 전략적 건강 혁신 파트너십 (SHIP)도 DSI의 자금으로 인정 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
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