Vi præsenterer en protokol for isolering og frysefrakturering af ekstracellulære vesikler (EV’er), der stammer fra kræftformige urotelceller. Frysebrudsteknikken afslørede elbilernes diameter og form og – som et unikt træk – den interne organisering af EV-membranerne. Disse er af enorm betydning for at forstå, hvordan elbiler interagerer med modtagermembranerne.
Ekstracellulære vesikler (EV’er) er membranbegrænsede strukturer frigivet fra cellerne ind i det ekstracellulære rum og er impliceret i intercellulær kommunikation. Elbiler består af tre populationer af vesikler, nemlig mikrovesikler (PV’er), exosomer og apoptotiske kroppe. Den begrænsende membran i elbiler er afgørende involveret i interaktionerne med modtagercellerne, hvilket kan føre til overførsel af biologisk aktive molekyler til modtagercellerne og følgelig påvirke deres adfærd. Frysefrakturelektronmikroskopiteknikken bruges til at studere den interne organisation af biologiske membraner. Her præsenterer vi en protokol for MV-isolering fra dyrkede kræfturotelceller og frysefraktur af MV’er i trinene til hurtig frysning, frakturering, fremstilling og rengøring af replikaerne og analyse af dem med transmissionselektronmikroskopi. Resultaterne viser, at protokollen for isolering giver en homogen population af elbiler, som svarer til formen og størrelsen af EV’er. Intramembranpartikler findes hovedsageligt i den protoplasmatiske overflade af den begrænsende membran. Derfor er frysefraktur den valgte teknik til at karakterisere MW’ernes diameter, form og fordeling af membranproteiner. Den fremlagte protokol gælder for andre populationer af elbiler.
Ekstracellulære vesikler (EV’er) er membranbegrænsede vesikler frigivet fra celler ind i det ekstracellulære rum. De tre vigtigste populationer af elbiler er exosomer, mikrovesikler (MF’er) og apoptotiske legemer, som adskiller sig i deres oprindelse, størrelse og molekylære sammensætning 1,2,3. Sammensætningen af elbiler afspejler donorcellens molekylære profil og dens fysiologiske status (dvs. sund eller syg)4,5. Dette giver elbiler et enormt potentiale i diagnosticering, prognose og terapi af menneskelige sygdomme, og de har lovende medicinske anvendelser til brug i personlig medicin 6,7,8.
Elbiler er mediatorer af intercellulær kommunikation. De indeholder biologisk aktive proteiner, lipider og RNA’er, som forstyrrer biologiske processer i modtagercellen og kan ændre dens adfærd 9,10. Sammensætningen af EV-begrænsende membran er imidlertid afgørende for interaktionen med modtagercellemembranen.
Kilderne til elbiler er kropsvæsker og betingede kulturmedier. For at isolere en EV-population skal der anvendes en passende isolationsteknik. For eksempel giver centrifugering ved 10.000 × g en fraktion beriget i MF’er, mens centrifugalkræfter på ≥100.000 × g giver en fraktion beriget i exosomer11,12. Den isolerede del af elbiler skal valideres med hensyn til renhed, størrelse og form. Til dette formål anbefalede International Society for Extracellular Vesicles 2018 tre klasser af billeddannelsesteknikker med høj opløsning: elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og lysmikroskopibaseret superopløsningsmikroskopi13. Ingen af disse teknikker kan give oplysninger om EV-membranens interiør.
Frysefrakturelektronmikroskopi er en teknik til at bryde frosne prøver for at afsløre deres indre strukturer, især ved at give et billede af membranens indre. Trinene i prøveforberedelsen er (1) hurtig frysning, (2) frakturering, (3) fremstilling af replikaen og (4) rengøring af replikaen14. I trin 1 fastgøres prøven (valgfrit) kemisk, kryobeskyttet med glycerol og fryses i flydende freon. I trin 2 brydes den frosne prøve i en frysefrakturenhed, som udsætter det indre af membrandobbeltlaget. I trin 3 skygges de eksponerede brudte ansigter med platin (Pt) og kulstof (C) for at producere replikaer. I trin 4 fjernes det organiske materiale. Replikaen analyseres i transmissionselektronmikroskopet (TEM). For nøjagtig fortolkning af mikrograferne skal man følge retningslinjer for deres korrekte orientering14,15. Kort fortalt er skyggeretningen i mikrografen en henvisning til at orientere mikrografen (dvs. at bestemme retningen af Pt-skygge) og følgelig at bestemme konvekse og konkave former (figur 1). To indvendige visninger kaldet brudte flader af membrandobbeltlaget kan ses som et resultat af opdeling af membranen ved frysefrakturering: det protoplasmatiske ansigt (P-ansigt) og det eksoplasmatiske ansigt (E-ansigt). P-ansigtet repræsenterer membranfolderen ved siden af celleprotoplasmaet, mens E-ansigtet repræsenterer membranfolderen ved siden af det ekstracellulære rum. Integrerede membranproteiner og deres foreninger ses som fremspringende intramembranpartikler 14,15.
Her er målet at anvende frysefrakturteknikken til at karakterisere MV’er med hensyn til størrelse, form og strukturen af deres begrænsende membran. Her præsenterer vi en protokol for isolering og frysefrakturering af MV’er, der stammer fra humane invasive blærekræft urotelceller.
Karakteriseringen af MV’er eller enhver anden population af isolerede elbiler er af største betydning til at begynde med, før man starter downstream-analyser som “omics” -undersøgelser eller funktionelle undersøgelser11,18. Heri blev elbiler fra humane invasive blærekræft urotelial T24-celler isoleret ved centrifugering, og efter den medfølgende protokol til analyse ved frysefrakturelektronmikroskopi demonstrerede vi, at den isolerede fraktion blev beriget i MF’er11,13. Isolatet af MV’er var blottet for celleaffald eller organeller, hvilket bekræftede en vellykket isolerings- og rensningsprotokol.
Kombinationen af kemisk fiksering og frysning, som er kritiske trin i protokollen, bevarede den sfæriske form afelbilerne 12. Der er dog behov for forholdsregler ved vurdering af EV-diameter vedfrysefrakturering 17. Da bruddet passerer tilfældigt gennem prøven, opdeles MV-membraner i deres ækvatoriale og ikke-ækvatoriale planer. For at give en streng metode til analyse af billederne af frysebrudte og skyggede prøver viste Hallett et al., at den gennemsnitlige vesikeldiameter er 4/π gange den faktiske størrelse af vesikulær diameter på billedet17. Når man tager højde for det, blev elbiler fra T24-celler beregnet til at have en diameter på 304 nm, hvilket passer i MV’s teoretiske størrelsesfordelingsområde på 100-1000 nm19.
Frysefrakturering kan supplere negativ farvning, den mest anvendte TEM-teknik til at visualisere elbiler. Ved negativ farvning fastgøres prøven almindeligvis kemisk, tørres og fastgøres til et TEM-gitter og kontrasteres med uranylopløsning. Uden understøttende medier har elbiler en tendens til at kollapse, hvilket giver dem et kopformet udseende. Ved frysefrakturering viser vi, at MV’er er kugler, som afspejler deres form i ekstracellulære rum og kropsvæsker12. Dermed stemmer vores resultater også overens med observationer af elbiler i kryo-ultratynde afsnit20.
En afgørende fordel ved frysefrakturteknikken er dens evne til at løse den interne organisering af den begrænsende membran, hvilket er en nøglefaktor i forståelsen af, hvordan elbiler er målrettet mod og interagerer med modtagermembraner. Her analyserede vi membranerne i ELBILER, men frysefrakturering kunne afsløre membranorganisationen for enhver anden population af elbiler. MV’er er dannet af plasmamembranspiring; derfor forventes plasmamembranproteiner og proteinklynger at blive fundet i MV-membranen. Vores resultater understøttede, at MV’erne fra T24-celler indeholdt intramembranpartikler, der præsenterede integrerede membranproteiner. Baseret på partikelfordeling mellem E-face og P-face er det rimeligt at forvente, at de partikler, der observeres i MF’er, er transmembranproteiner uroplakiner, som er urotelcellespecifikke21,24. De observerede partikler var sparsomme, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterer en reduktion i uroplakiner under urotelial carcinogenese 21,22,23. For yderligere at undersøge proteinsammensætningen af MV-membraner anbefales det imidlertid at anvende frysefraktur replika immunmærkning (FRIL) teknik. FRIL er en opgradering af den præsenterede frysefrakturteknik og er dedikeret til at afsløre identiteten af proteiner i replikaer ved antistofgenkendelse24,25. Sammenfattende er frysefrakturteknikken en elektronmikroskopiteknik, der er egnet til karakterisering af EV-begrænsende membran samt formen, størrelsen og renheden af de isolerede EV-fraktioner. Den fremlagte protokol kan også bruges til vurdering af andre populationer af isolerede elbiler; derfor fortjener frysefraktureringsteknikken optagelse i International Society for Extracellular Vesicles retningslinjer for undersøgelser, der undersøger organisationen af EV-begrænsende membraner.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af det slovenske forskningsagentur (forskningskernefinansiering nr. P3-0108 og projekt J7-2594) og MRIC UL IP-0510 Infrastrukturprogrammet. Dette arbejde bidrager til COST-aktionen CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), støttet af COST (European Cooperation in Science and Technology). Forfatterne vil gerne takke Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič og Sabina Železnik for teknisk hjælp med celledyrkning og forberedelse af prøverne og Marko Vogrinc, Ota Širca Roš og Nejc Debevec for teknisk hjælp til at forberede videoen.
A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
Tweezers | SPI, United States |