धूमकेतु परख डीएनए क्षति का पता लगाने का एक लोकप्रिय साधन है। यह अध्ययन धूमकेतु परख के प्रतिनिधि वेरिएंट में स्लाइड चलाने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण ने परख रन-टाइम, स्लाइड जोड़तोड़ की संख्या और जैल को नुकसान के जोखिम को कम करते हुए नमूनों की संख्या में काफी वृद्धि की।
कोशिकाएं लगातार आंतरिक और बाहरी वातावरण से उत्पन्न होने वाले एजेंटों के संपर्क में आती हैं, जो डीएनए को नुकसान पहुंचा सकती हैं। यह क्षति असामान्य सेल फ़ंक्शन का कारण बन सकती है, और इसलिए डीएनए क्षति सभी प्रमुख मानव रोगों, जैसे, कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी और उम्र बढ़ने के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। सिंगल-सेल जेल वैद्युतकणसंचलन (यानी, धूमकेतु परख) डीएनए क्षति की एक विस्तृत श्रृंखला के गठन और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए सबसे आम और संवेदनशील तरीकों में से एक है (उदाहरण के लिए, एकल और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, क्षार-लेबिल साइट, डीएनए-डीएनए क्रॉसलिंक, और, कुछ मरम्मत एंजाइमों, ऑक्सीकृत प्यूरीन और पाइरिमिडाइन के साथ संयोजन में), विट्रो और विवो दोनों में । सिस्टम। हालांकि, पारंपरिक परख और श्रमसाध्य नमूना वर्कअप के कम नमूना थ्रूपुट इसके व्यापक संभव अनुप्रयोग के लिए कारकों को सीमित कर रहे हैं। धूमकेतुओं के “स्कोरिंग” के साथ तेजी से स्वचालित, सीमा अब धूमकेतु स्लाइड की महत्वपूर्ण संख्या को संसाधित करने की क्षमता है। यहां, धूमकेतु परख (एचटीपी धूमकेतु परख) का एक उच्च-थ्रूपुट (एचटीपी) संस्करण विकसित किया गया है, जो विश्लेषण किए गए नमूनों की संख्या में काफी वृद्धि करता है, परख रन टाइम को कम करता है, व्यक्तिगत स्लाइड जोड़तोड़ की संख्या, अभिकर्मक आवश्यकताओं और जैल को शारीरिक क्षति का जोखिम। इसके अलावा, स्लाइड के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास और अभिन्न शीतलन के कारण वैद्युतकणसंचलन टैंक के पदचिह्न में काफी कमी आई है। यहां धूमकेतु परख स्लाइड्स को ठंडा करने के लिए एक नया दृष्टिकोण भी बताया गया है, जो धूमकेतु जैल के जमने की सुविधा आसानी से और कुशलता से प्रदान करता है। यहां, प्रतिनिधि धूमकेतु परख विधियों के लिए इन उपकरणों के आवेदन का वर्णन किया गया है। ये सरल नवाचार धूमकेतु परख के उपयोग और अध्ययन के क्षेत्रों जैसे एक्सपोजर बायोलॉजी, इकोटॉक्सिकोलॉजी, बायोमॉनिटरिंग, विषाक्तता स्क्रीनिंग / परीक्षण के साथ-साथ रोगजनन को समझने के लिए इसके आवेदन का बहुत समर्थन करते हैं।
कोशिकाओं को आंतरिक और बाहरी वातावरण से उत्पन्न होने वाले एजेंटों के लगातार संपर्क में लाया जाता है, जो डीएनए1,2 को नुकसान पहुंचा सकता है। यह क्षति असामान्य सेल फ़ंक्शन3 का कारण बन सकती है, और इसलिए डीएनए क्षति कई प्रमुख मानव रोगों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है, जैसे, कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव और कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, और उम्र बढ़ने4। धूमकेतु परख (जिसे एकल-सेल जेल वैद्युतकणसंचलन भी कहा जाता है) सेलुलर डीएनए क्षति का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तरीका है।
अपने सबसे सरलतम पर, क्षारीय धूमकेतु परख (एसीए) स्ट्रैंड ब्रेक (एसबी; एकल और डबल दोनों) का पता लगाता है, साथ ही एपुरिनिक / एपिरिमिडिनिक साइटों और क्षार-लेबिल साइटों (एएलएस) के साथ, जिनमें से दोनों क्षारीय परिस्थितियोंमें एकल-स्ट्रैंड ब्रेक बन जाते हैं। तटस्थ पीएच धूमकेतु परख फ्रैंक सिंगल- और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक6 का मूल्यांकन कर सकती है। इसके अलावा, एसीए, कई डीएनए मरम्मत एंजाइमों के संयोजन में, डीएनए क्षति के काफी प्रकार का पता लगा सकता है, उदाहरण के लिए, ऑक्सीकृत प्यूरीन (मानव 8-ऑक्सोगुआनिन डीएनए ग्लाइकोसिलेज 1; एचओजीजी 17 के उपयोग से पहचाना जाता है); ऑक्सीकृत पाइरिमिडाइन (एंडोन्यूक्लिज़ III का उपयोग करके; एंडोIII) और साइक्लोब्यूटेन पाइरिमिडीन डिमर (टी 4 एंडोन्यूक्लिज़ वी का उपयोग करके; T4endoV)8. धूमकेतु परख का उपयोग क्रॉसलिंकिंग एजेंटों द्वारा प्रेरित डीएनए घावों का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि सिस्प्लाटिन 9,10,11। जैसा कि परख के औपचारिक नाम, यानी, एकल सेल जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इंगित किया गया है, परख एकल सेल निलंबन होने के नाते विश्लेषण के तहत कोशिकाओं पर निर्भर करता है; आमतौर पर, ये सुसंस्कृत कोशिकाएं होती हैं लेकिन पूरे रक्त12,13 से अलग हो सकती हैं, या पूरे रक्त का उपयोग14,15 किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ठोस ऊतकों से एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न हो सकता है।
कुछ अपवादों के अलावा, विशेष रूप से एंगलवर्ड लैब16 से कॉमेटचिप रिपोर्ट, समग्र धूमकेतु परख प्रोटोकॉल मूल रूप से परख के आविष्कारकों (ओस्टलिंग और जोहानसन 17 और सिंह एट अल.18) द्वारा वर्णित से नाटकीय रूप से नहीं बदला है। धूमकेतु परख में कई चरण शामिल हैं (चित्रा 1)। इनमें से कई चरणों में पतले, सेल युक्त अगारोस जैल का स्थानांतरण शामिल है, एक समय में एक स्लाइड, और इसलिए, जेल के नुकसान या हानि का खतरा पैदा करता है, जिससे प्रयोग की सफलता खतरे में पड़ जाती है। नतीजतन, धूमकेतु परख समय लेने वाली हो सकती है, खासकर अगर बड़ी संख्या में स्लाइड चलाए जा रहे हैं। आमतौर पर, अधिकतम 40 स्लाइडएक बड़े (33 सेमी x 59 सेमी x 9 सेमी) वैद्युतकणसंचलन टैंक में चलाए जाते हैं, जो ठंडा करने के लिए गीली बर्फ युक्त एक और भी बड़ी ट्रे के भीतर बैठता है। हाल ही में यह बताया गया है कि लाइसिस चरण की अवधि को कम करके और19 को धुंधला करने से पहले स्लाइड्स को सुखाकर परख रनटाइम को 1 दिन तक छोटा किया जा सकता है।
वर्तमान लेखकों ने पहले उच्च थ्रूपुट क्षारीय धूमकेतु परख (एचटीपी एसीए) के लिए एक नया दृष्टिकोण बताया है, जिसमें कई (25 के बैच) धूमकेतु परख माइक्रोस्कोप स्लाइड को धूमकेतु परख प्रक्रिया20,21,22 में एक साथ हेरफेर किया जा सकता है। यह पेटेंट दृष्टिकोण माइक्रोस्कोप स्लाइड्स को व्यक्तिगत रूप से हेरफेर करने की आवश्यकता को हटाकर नमूना युक्त जैल को नुकसान या हानि के जोखिम को कम करता है और धूमकेतु परख के सभी रूपों पर लागू किया जा सकता है, जो माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करते हैं। स्लाइड युक्त रैक जोड़तोड़ के दौरान जैल की रक्षा करते हैं, और नतीजतन, नमूना प्रसंस्करण तेज और अधिक कुशल होता है। स्लाइड क्षैतिज, अभिविन्यास के बजाय ऊर्ध्वाधर में आयोजित रैक में वैद्युतकणसंचलन से भी गुजर सकते हैं। यह, और अभिन्न शीतलन, वैद्युतकणसंचलन टैंक के पदचिह्न को काफी कम कर देता है और गीली बर्फ की आवश्यकता को दूर करता है। एक साथ लिया गया, यह पारंपरिक प्रक्रिया पर एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। उपयोग किए गए उपकरण चित्र 2 में चित्रित किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल, इस नए दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, क्षार-लेबिल साइटों (एएलएस), डीएनए इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक्स (आईसीएल), और विभिन्न डीएनए मरम्मत एंजाइमों के सब्सट्रेट्स का पता लगाने के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं और पूरे रक्त14 के प्रतिनिधि अनुप्रयोग को प्रदर्शित करते हैं।
यह अध्ययन वर्तमान उपकरणों द्वारा प्रदान की गई बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है, जिसका उपयोग धूमकेतु परख के विभिन्न प्रतिनिधि, सामान्य रूपों (यानी, क्षारीय, एंजाइम-संशोधित, रक्त, और आईसीएल, और अन्य वेरिएंट भी उपयुक्त होंगे) के साथ उच्च थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान दृष्टिकोण अपने साथ कई लाभ लाता है20,21: (ए) समानांतर में कई स्लाइडों के हेरफेर के कारण परख रन टाइम कम हो जाता है (हैंडलिंग समय 60% तक कम हो जाता है); (बी) जैल को नुकसान का जोखिम, और इसलिए प्रयोग के लिए जोखिम कम हो जाता है; (ग) अभिकर्मक आवश्यकताओं में कमी आई है (उदाहरण के लिए, वैद्युतकणसंचलन टैंक की मात्रा पारंपरिक टैंक की तुलना में छोटी है); (घ) रन किए गए स्लाइडों की संख्या में वृद्धि की गई है। एक टैंक एकल पारंपरिक टैंक की तुलना में चलने वाली स्लाइडों की संख्या में 20% की वृद्धि प्रदान कर सकता है; हालांकि, एक ही बिजली की आपूर्ति के समानांतर कई वैद्युतकणसंचलन टैंकों को चलाया या गुलाम बनाया जा सकता है (यानी, एक ही बिजली की आपूर्ति द्वारा नियंत्रित कई टैंक), और अभी भी बर्फ ट्रे के साथ एकल पारंपरिक टैंक से छोटे बेंचटॉप पदचिह्न की आवश्यकता होती है; और (ई) स्लाइड और इंटीग्रल कूलिंग के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास के कारण टैंक पदचिह्न कम हो जाता है (प्रयोगशाला स्थान बचाता है); एचटीपी टैंक में स्लाइडिंग दराज के साथ एक उच्च प्रदर्शन सिरेमिक कूलिंग बेस शामिल है जो ठंडे कमरे में प्रक्रिया किए बिना इष्टतम बफर तापमान बनाए रखने के लिए एक जमे हुए शीतलन पैक को फिट कर सकता है।
इसके अलावा, हमारे द्वारा विकसित चिलिंग प्लेट 26 धूमकेतु स्लाइडों को समायोजित करती है, धूमकेतु परख स्लाइड पर कम पिघलने बिंदु अगारोस के तेजी से ठोसकरण को सक्षम करती है और अगारोस जेल के जमने के बाद स्लाइडों की आसान पुनर्प्राप्ति की सुविधा प्रदान करती है। उपरोक्त नवाचार धूमकेतु परख प्रक्रिया को सरल और आसान बनाते हैं।
जबकि अन्य उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं (उदाहरण के लिए, 12-जेल धूमकेतु परख, धूमकेतु, या 96 मिनी-जेल प्रारूप)25, कई वैज्ञानिक पारंपरिक माइक्रोस्कोप स्लाइड (जिसमें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व-लेपित स्लाइड, या अन्य विशेष स्लाइड शामिल हैं) का उपयोग करना पसंद करते हैं। वर्तमान दृष्टिकोण सभी प्रकार के माइक्रोस्कोप स्लाइडों को समायोजित कर सकता है, जिससे इन स्लाइडों का उपयोग करने वाले प्रयोगों को तेजी से स्लाइड प्रोसेसिंग और हैंडलिंग के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एचटीपी धूमकेतु प्रणाली कई फायदे लाती है, लेकिन एक उल्लेखनीय सीमा है: वर्तमान दृष्टिकोण पारंपरिक क्षैतिज टैंक की तुलना में चलने वाले नमूनों की संख्या में केवल 20% की वृद्धि प्रदान करता है (हालांकि स्लाइड का प्रसंस्करण बहुत तेज है)। धूमकेतुचिप और 96 मिनी-जेल प्रारूप अधिक संख्या में नमूने चलाते हैं। आज तक, हम नहीं जानते कि वर्तमान दृष्टिकोण धूमकेतु या 96 मिनी-जेल प्रारूपों को समायोजित कर सकता है, हालांकि हम भविष्यवाणी करते हैं कि यह होगा। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, नमूनों की संख्या को एकल बिजली की आपूर्ति के लिए टैंकों को स्लाव करके और बढ़ाया जा सकता है। सभी दृष्टिकोणों के साथ, नमूने लोड करते समय और माइक्रोस्कोप के तहत उनका विश्लेषण करते समय जैल को खोने या नुकसान पहुंचाने का मौका अभी भी है, लेकिन यह ऑपरेटर त्रुटि के कारण अधिक है, और वर्तमान दृष्टिकोण के साथ इसकी संभावना कम हो जाती है।
एचटीपी धूमकेतु प्रणाली का उपयोग डीएनए क्षति का विश्लेषण करने में बहुत मदद कर सकता है, आणविक महामारी विज्ञान, पुरुष प्रजनन विज्ञान, जीनोटॉक्सिकोलॉजी अध्ययन और पर्यावरण विष विज्ञान जैसे अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में धूमकेतु परख के उपयोग की सुविधा प्रदान करता है। यह उन उपयोगकर्ताओं के लिए विशेष रूप से सच है जो परिचित, लागत प्रभावी, पारंपरिक माइक्रोस्कोप स्लाइड से दूर जाने के बिना, बेहतर थ्रूपुट, और उपयोग में आसानी के सभी लाभ प्राप्त करना चाहते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए काम को आंशिक रूप से, पुरस्कार संख्या: 1R41ES030274 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है।
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
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Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
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Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |