Kometanalysen er et populært middel for å oppdage DNA-skade. Denne studien beskriver en tilnærming til å kjøre lysbilder i representative varianter av kometanalysen. Denne tilnærmingen økte antall prøver betydelig samtidig som den reduserte analysens kjøretid, antall lysbildemanipulasjoner og risikoen for skade på geler.
Celler blir kontinuerlig utsatt for midler som oppstår fra interne og eksterne miljøer, noe som kan skade DNA. Denne skaden kan forårsake avvikende cellefunksjon, og derfor kan DNA-skade spille en kritisk rolle i utviklingen av tenkelig alle store menneskelige sykdommer, for eksempel kreft, nevrodegenerativ og kardiovaskulær sykdom og aldring. Encellet gelelektroforese (dvs. kometanalysen) er en av de vanligste og mest følsomme metodene for å studere dannelsen og reparasjonen av et bredt spekter av typer DNA-skader (f.eks. Enkelt- og dobbeltstrengsbrudd, alkali-labile steder, DNA-DNA-tverrbindinger, og i kombinasjon med visse reparasjonsenzymer, oksyderte puriner og pyrimidiner), i både in vitro og in vivo Systemer. Imidlertid er den lave prøvegjennomstrømningen av den konvensjonelle analysen og arbeidskrevende prøveopparbeidelse begrensende faktorer til bredest mulig anvendelse. Med “scoring” av kometer stadig mer automatisert, er begrensningen nå muligheten til å behandle et betydelig antall kometlysbilder. Her er det utviklet en høykapasitetsvariant (HTP) variant av kometanalysen (HTP-kometanalysen), noe som øker antall analyserte prøver betydelig, reduserer analysens kjøretid, antall individuelle lysbildemanipulasjoner, reagenskrav og risiko for fysisk skade på gelene. Videre reduseres fotavtrykket til elektroforesetanken betydelig på grunn av den vertikale orienteringen av lysbildene og integrert kjøling. Også rapportert her er en ny tilnærming til chilling komet analyse lysbilder, som praktisk og effektivt letter størkning av kometen geler. Her er anvendelsen av disse enhetene til representative kometanalysemetoder beskrevet. Disse enkle innovasjonene støtter i stor grad bruken av kometanalysen og dens anvendelse på studieområder som eksponeringsbiologi, økotoksikologi, biomonitorering, toksisitetsscreening / testing, sammen med forståelse av patogenese.
Celler blir kontinuerlig utsatt for agenter som oppstår fra interne og eksterne miljøer, noe som kan skade DNA 1,2. Denne skaden kan forårsake avvikende cellefunksjon3, og derfor kan DNA-skade spille en kritisk rolle i utviklingen av mange store menneskelige sykdommer, for eksempel kreft, nevrodegenerativ og kardiovaskulær sykdom og aldring4. Kometanalysen (også kalt encellet gelelektroforese) er en stadig mer populær metode for å oppdage og kvantifisere cellulær DNA-skade.
På sitt enkleste oppdager den alkaliske kometanalysen (ACA) strengbrudd (SB; både enkle og doble), sammen med apuriniske/apyrimidiniske steder og alkali-labile steder (ALS), som begge blir enkeltstrengsbrudd under alkaliske forhold5. Den nøytrale pH-kometanalysen kan evaluere ærlige enkelt- og dobbeltstrengsbrudd6. Videre kan ACA, i kombinasjon med en rekke DNA-reparasjonsenzymer, oppdage et betydelig utvalg av typer DNA-skader, for eksempel oksyderte puriner (identifisert ved bruk av humant 8-oksoguanin DNA-glykosylase 1; hOGG17); oksyderte pyrimidiner (ved bruk av Endonuklease III; EndoIII) og cyklobutanpyrimidindimerer (ved bruk av T4 endonuklease V; T4endoV)8. Kometanalysen kan også brukes til å evaluere DNA-lesjoner indusert av tverrbindingsmidler, for eksempel cisplatin 9,10,11. Som indikert av analysens formelle navn, dvs. enkeltcellegelelektroforese, er analysen avhengig av at cellene som analyseres er en enkeltcellesuspensjon; Vanligvis er disse dyrkede celler, men kan isoleres fra fullblod 12,13, eller fullblod i seg selv kan brukes 14,15. Alternativt kan en enkelt cellesuspensjon genereres fra fast vev.
Bortsett fra noen få unntak, spesielt CometChip-rapportene fra Engleward lab 16, har den generelle kometanalyseprotokollen ikke endret seg dramatisk fra den som opprinnelig ble beskrevet av analysens oppfinnere (Östling og Johansson17 og Singh etal.18). Kometanalysen omfatter mange trinn (figur 1). Mange av disse trinnene innebærer overføring av de tynne, celleholdige agarosegelene, ett lysbilde om gangen, og utgjør derfor en risiko for skade eller tap av gelen, noe som truer eksperimentets suksess. Følgelig kan kometanalysen være tidkrevende, spesielt hvis et betydelig antall lysbilder kjøres. Vanligvis kjøres maksimalt 40 lysbilder i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforesetank, som sitter i et enda større brett som inneholder våt is for kjøling. Det har nylig blitt rapportert at analysens kjøretid kan forkortes til 1 dag ved å redusere varigheten av lysistrinnet og ikke tørke lysbildene før farging19.
De nåværende forfatterne har tidligere rapportert en ny tilnærming til alkalisk kometanalyse med høy gjennomstrømning (HTP ACA), der flere (batcher på 25) kometanalysemikroskoplysbilder kan manipuleres samtidig gjennom kometanalyseprosessen20,21,22. Denne patenterte tilnærmingen minimerer risikoen for skade på eller tap av de prøveholdige gelene ved å fjerne behovet for å manipulere mikroskoplysbildene individuelt og kan brukes på alle varianter av kometanalysen, som bruker mikroskoplysbilder. De glidende stativene beskytter gelene under manipulasjonene, og følgelig er prøvebehandlingen raskere og mer effektiv. Lysbildene kan også gjennomgå elektroforese i stativene, holdt i vertikal, i stedet for horisontal orientering. Dette, og integrert kjøling, reduserer fotavtrykket til elektroforesetanken betydelig og fjerner behovet for våt is. Til sammen representerer dette en betydelig forbedring i forhold til den konvensjonelle prosedyren. Utstyret som brukes er illustrert i figur 2. Protokollene beskrevet her, ved hjelp av denne nye tilnærmingen, demonstrerer den representative applikasjonen til dyrkede celler og fullblod14 for påvisning av alkali-labile steder (ALS), DNA-tverrbindinger (ICL) og substratene til forskjellige DNA-reparasjonsenzymer.
Denne studien demonstrerer allsidigheten som tilbys av det nåværende utstyret, som kan brukes til å oppnå høy gjennomstrømning med en rekke representative, vanlige varianter av kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodifisert, blod og ICL, og andre varianter vil også være egnet). I tillegg bringer den nåværende tilnærmingen med seg flere fordeler 20,21: (a) analysens kjøretid reduseres på grunn av manipulering av flere lysbilder parallelt (håndteringstiden reduseres med60%); b) risikoen for skade på geleer, og dermed reduseres risikoen for forsøket, (c) reagensbehovet reduseres (f.eks. er volumet av elektroforesetanken mindre enn den konvensjonelle tanken); (d) antall lysbilder kjøres økes. En tank kan gi en 20% økning i antall lysbilder som kjøres sammenlignet med en enkelt konvensjonell tank; Imidlertid kan flere elektroforesetanker kjøres eller slaves (dvs. flere tanker styres av en enkelt strømforsyning), parallelt fra samme strømforsyning, og krever fortsatt et stasjonært fotavtrykk mindre enn en enkelt konvensjonell tank med isbrett; og (e) tankavtrykket reduseres på grunn av vertikal orientering av lysbilder og integrert kjøling (sparer laboratorieplass); HTP-tanken består av en keramisk kjølebase med høy ytelse med en glideskuff som kan passe til en frossen kjølepakke for å opprettholde optimal buffertemperatur uten å måtte utføre prosessen i et kaldt rom.
Videre har kjøleplaten utviklet av oss plass til 26 kometsklier, muliggjør rask størkning av det lave smeltepunktet agarose på kometanalysens lysbilder og letter en enkel gjenfinning av lysbildene etter at agarosegelen er størknet. Ovennevnte innovasjoner gjør kometanalyseprosessen enklere og enklere.
Mens andre tilnærminger med høy gjennomstrømning er utviklet (f.eks. 12-gels kometanalyse, CometChip eller 96 mini-gelformater)25, foretrekker mange forskere å bruke de konvensjonelle mikroskoplysbildene (som inkluderer kommersielt tilgjengelige forhåndsbelagte lysbilder eller andre spesialiserte lysbilder). Den nåværende tilnærmingen kan romme alle typer mikroskop lysbilder, slik at eksperimenter ved hjelp av disse lysbildene skal skaleres opp gjennom raskere lysbildebehandling og håndtering. Som nevnt ovenfor gir HTP-kometsystemet mange fordeler, men det er en bemerkelsesverdig begrensning: den nåværende tilnærmingen gir bare en 20% økning i antall prøver som kjøres, sammenlignet med en konvensjonell horisontal tank (selv om behandlingen av lysbilder er mye raskere). CometChip og 96 mini-gel formater kjører et større antall prøver. Til dags dato vet vi ikke om den nåværende tilnærmingen kan imøtekomme CometChip eller 96 mini-gelformater, selv om vi spår at det vil. Som nevnt ovenfor kan antall prøver økes ytterligere ved å slave tanker til en enkelt strømforsyning. Som med alle tilnærminger, er det fortsatt en sjanse for å miste eller skade gelene mens du laster prøver og analyserer dem under mikroskopet, men dette skyldes mer operatørfeil, og sjansene for dette minimeres med dagens tilnærming.
Bruken av HTP-kometsystemet kan i stor grad bidra til å analysere DNA-skade, noe som letter bruken av kometanalysen i et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel molekylær epidemiologi, mannlig reproduktiv vitenskap, gentoksikologistudier og miljøtoksikologi. Dette gjelder spesielt for de brukerne som ønsker å ha alle fordelene med forbedret gjennomstrømning og brukervennlighet, uten å bevege seg bort fra de kjente, kostnadseffektive, konvensjonelle mikroskopglassene.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet som ble rapportert i denne publikasjonen ble delvis støttet av National Institute of Environmental Health Sciences ved National Institutes of Health under tildelingsnummer: 1R41ES030274. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet til National Institutes of Health.
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |