Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.
Le cellule sono continuamente esposte ad agenti provenienti dagli ambienti interni ed esterni, che possono danneggiare il DNA. Questo danno può causare una funzione cellulare aberrante, e quindi il danno al DNA può svolgere un ruolo critico nello sviluppo, presumibilmente, di tutte le principali malattie umane, ad esempio il cancro, le malattie neurodegenerative e cardiovascolari e l’invecchiamento. L’elettroforesi su gel a singola cellula (cioè il saggio della cometa) è uno dei metodi più comuni e sensibili per studiare la formazione e la riparazione di una vasta gamma di tipi di danni al DNA (ad esempio, rotture di filamenti singoli e doppi, siti alcalino-labili, legami incrociati DNA-DNA e, in combinazione con alcuni enzimi di riparazione, purine ossidate e pirimidine), sia in vitro che in vivo . Sistemi. Tuttavia, la bassa produttività del campione del test convenzionale e il laborioso lavoro del campione sono fattori limitanti per la sua più ampia applicazione possibile. Con il “punteggio” delle comete sempre più automatizzato, il limite è ora la capacità di elaborare un numero significativo di diapositive di comete. Qui è stata sviluppata una variante ad alto rendimento (HTP) del test cometa (HTP comet assay), che aumenta significativamente il numero di campioni analizzati, diminuisce il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni individuali dei vetrini, i requisiti di reagenti e il rischio di danni fisici ai gel. Inoltre, l’ingombro del serbatoio di elettroforesi è significativamente ridotto a causa dell’orientamento verticale delle guide e del raffreddamento integrale. Qui è riportato anche un nuovo approccio per raffreddare i vetrini di analisi delle comete, che facilita convenientemente ed efficacemente la solidificazione dei gel della cometa. Qui è stata descritta l’applicazione di questi dispositivi a metodi rappresentativi di analisi cometa. Queste semplici innovazioni supportano notevolmente l’uso del saggio della cometa e la sua applicazione ad aree di studio come la biologia dell’esposizione, l’ecotossicologia, il biomonitoraggio, lo screening / test di tossicità, insieme alla comprensione della patogenesi.
Le cellule sono esposte continuamente ad agenti provenienti dagli ambienti interni ed esterni, che possono danneggiare il DNA 1,2. Questo danno può causare la funzione cellulare aberrante3, e quindi il danno al DNA può svolgere un ruolo critico nello sviluppo di molte delle principali malattie umane, ad esempio il cancro, le malattie neurodegenerative e cardiovascolari e l’invecchiamento4. Il saggio della cometa (chiamato anche elettroforesi su gel a singola cellula) è un metodo sempre più popolare per rilevare e quantificare il danno al DNA cellulare.
Nella sua forma più semplice, il saggio alcalino della cometa (ACA) rileva le rotture del filamento (SB; sia singole che doppie), insieme ai siti apurinici/apirimidinici e ai siti alcalino-labili (SLA) che diventano entrambi rotture a singolo filamento in condizioni alcaline5. Il test della cometa a pH neutro può valutare le rotture franche di un singolo e doppio filamento6. Inoltre, l’ACA, in combinazione con un certo numero di enzimi di riparazione del DNA, può rilevare una gamma considerevole di tipi di danni al DNA, ad esempio purine ossidate (identificate mediante l’uso di 8-ossoguanina DNA glicosilasi umana 1; hOGG17); pirimidine ossidate (utilizzando Endonucleasi III; EndoIII) e dimeri di pirimidina ciclobutano (utilizzando l’endonucleasi T4 V; T4endoV)8. Il saggio della cometa può anche essere utilizzato per valutare le lesioni del DNA indotte da agenti reticolanti, come il cisplatino 9,10,11. Come indicato dal nome formale del test, cioè elettroforesi su gel a singola cellula, il test si basa sul fatto che le cellule in analisi sono una sospensione a singola cellula; Più comunemente, queste sono cellule in coltura, ma possono essere isolate dal sangue intero 12,13, o il sangue intero stesso può essere usato 14,15. In alternativa, una sospensione monocellulare può essere generata da tessuti solidi.
A parte alcune eccezioni, in particolare i rapporti CometChip del laboratorio Engleward 16, il protocollo complessivo di analisi delle comete non è cambiato radicalmente da quello originariamente descritto dagli inventori del saggio (Östling e Johansson17 e Singh etal.18). Il saggio della cometa comporta numerose fasi (Figura 1). Molti di questi passaggi comportano il trasferimento dei sottili gel di agarosio contenenti cellule, un vetrino alla volta e, quindi, comportano un rischio di danno o perdita del gel, compromettendo il successo dell’esperimento. Di conseguenza, il test della cometa può richiedere molto tempo, in particolare se viene eseguito un numero significativo di vetrini. In genere, un massimo di 40 vetrini vengono eseguiti in un grande serbatoio di elettroforesi (33 cm x 59 cm x 9 cm), che si trova all’interno di un vassoio ancora più grande contenente ghiaccio umido per il raffreddamento. È stato recentemente riportato che la durata del test può essere ridotta a 1 giorno diminuendo la durata della fase di lisi e non asciugando i vetrini prima della colorazione19.
I presenti autori hanno precedentemente riportato un nuovo approccio al saggio di cometa alcalina ad alta produttività (HTP ACA), in cui più (lotti di 25) vetrini da microscopio per comete possono essere manipolati simultaneamente durante il processo di analisi della cometa20,21,22. Questo approccio brevettato riduce al minimo il rischio di danneggiamento o perdita dei gel contenenti campioni eliminando la necessità di manipolare i vetrini del microscopio singolarmente e può essere applicato a tutte le varianti del test della cometa, che utilizzano vetrini da microscopio. I rack contenenti vetrini proteggono i gel durante le manipolazioni e, di conseguenza, l’elaborazione del campione è più rapida ed efficiente. Le guide possono anche essere sottoposte a elettroforesi nei rack, tenuti nell’orientamento verticale, anziché orizzontale. Questo, e il raffreddamento integrale, riducono significativamente l’ingombro del serbatoio di elettroforesi e rimuovono la necessità di ghiaccio umido. Nel complesso, ciò rappresenta un miglioramento significativo rispetto alla procedura convenzionale. L’attrezzatura utilizzata è illustrata nella figura 2. I protocolli qui descritti, utilizzando questo nuovo approccio, dimostrano l’applicazione rappresentativa alle cellule in coltura e al sangue intero14 per il rilevamento di siti alcali-labili (SLA), legami incrociati tra filamenti di DNA (ICL) e substrati di vari enzimi di riparazione del DNA.
Questo studio dimostra la versatilità fornita dall’attuale apparecchiatura, che può essere utilizzata per ottenere un elevato rendimento con una varietà di varianti rappresentative e comuni del saggio della cometa (cioè alcaline, enzima-modificate, sangue e ICL e altre varianti saranno anche adatte). Inoltre, l’approccio attuale porta con sé diversi vantaggi 20,21: (a) il tempo di esecuzione del saggio è ridotto a causa della manipolazione di più vetrini in parallelo (il tempo di manipolazione diminuisce del60%); b) il rischio di danni ai gel, e quindi il rischio per l’esperimento sono diminuiti; c) il fabbisogno di reagenti è diminuito (ad esempio, il volume del serbatoio di elettroforesi è inferiore a quello del serbatoio convenzionale); d) il numero di diapositive eseguite è aumentato. Un serbatoio può fornire un aumento del 20% del numero di slitte eseguite rispetto a un singolo serbatoio convenzionale; Tuttavia, più serbatoi di elettroforesi possono essere azionati o slavizzati (cioè più serbatoi controllati da un singolo alimentatore), in parallelo dallo stesso alimentatore, e richiedono comunque un ingombro da banco inferiore a un singolo serbatoio convenzionale con vassoio per il ghiaccio; e (e) l’ingombro del serbatoio è ridotto grazie all’orientamento verticale delle guide e al raffreddamento integrato (consente di risparmiare spazio in laboratorio); il serbatoio HTP comprende una base di raffreddamento in ceramica ad alte prestazioni con un cassetto scorrevole che può contenere un pacco di raffreddamento congelato per mantenere la temperatura ottimale del buffer senza dover eseguire il processo in una cella frigorifera.
Inoltre, la piastra di raffreddamento da noi sviluppata ospita 26 vetrini di comete, consente una rapida solidificazione dell’agarosio a basso punto di fusione sui vetrini di analisi della cometa e facilita un facile recupero dei vetrini dopo che il gel di agarosio è solidificato. Le innovazioni di cui sopra rendono il processo di analisi della cometa più semplice e più facile.
Sebbene siano stati sviluppati altri approcci ad alta produttività (ad esempio, test cometa a 12 gel, CometChip o 96 formati mini-gel)25, molti scienziati preferiscono utilizzare i vetrini convenzionali per microscopio (che includono i vetrini pre-rivestiti disponibili in commercio o altri vetrini specializzati). L’approccio attuale può ospitare tutti i tipi di vetrini da microscopio, consentendo agli esperimenti che utilizzano questi vetrini di essere scalati attraverso un’elaborazione e una gestione più veloci dei vetrini. Come notato sopra, il sistema di comete HTP porta molti vantaggi, ma c’è una limitazione notevole: l’approccio attuale fornisce solo un aumento del 20% del numero di campioni eseguiti, rispetto a un serbatoio orizzontale convenzionale (sebbene l’elaborazione dei vetrini sia molto più veloce). I formati CometChip e 96 mini-gel eseguono un numero maggiore di campioni. Ad oggi, non sappiamo se l’approccio attuale possa ospitare i formati CometChip o 96 mini-gel, anche se prevediamo che lo farà. Come notato sopra, il numero di campioni può essere ulteriormente aumentato schiavizzando i serbatoi a un singolo alimentatore. Come con tutti gli approcci, c’è ancora la possibilità di perdere o danneggiare i gel durante il caricamento dei campioni e l’analisi al microscopio, ma questo è più dovuto all’errore dell’operatore, e le possibilità di questo sono ridotte al minimo con l’approccio attuale.
L’uso del sistema cometario HTP può aiutare notevolmente ad analizzare il danno al DNA, facilitando l’uso del saggio cometario in una vasta gamma di applicazioni, come l’epidemiologia molecolare, la scienza riproduttiva maschile, gli studi di genotossicologia e la tossicologia ambientale. Ciò è particolarmente vero per quegli utenti che desiderano avere tutti i vantaggi di una migliore produttività e facilità d’uso, senza allontanarsi dai familiari, economici e convenzionali vetrini per microscopi.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro riportato in questa pubblicazione è stato, in parte, sostenuto dal National Institute of Environmental Health Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio: 1R41ES030274. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |