Protokollen som presenteres her tillater transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet menneskelig mikroglia (iPSMG) inn i hjernen via en transnasal rute i immunodumpente mus. Metoden for fremstilling og transnasal transplantasjon av celler og administrering av cytokinblanding for vedlikehold av iPSMG er vist.
Mikroglia er den spesialiserte befolkningen av makrofaglignende celler i hjernen. De spiller viktige roller i både fysiologiske og patologiske hjernefunksjoner. Det meste av vår nåværende forståelse av mikroglia er basert på eksperimenter utført i musen. Menneskelig mikroglia er forskjellig fra musmikroglia, og dermed kan respons og egenskaper av musmikroglia ikke alltid representere den for menneskelig mikroglia. Videre, på grunn av etiske og tekniske vanskeligheter, er forskning på menneskelig mikroglia begrenset til in vitro kultursystem, som ikke kapitulerer in vivo egenskaper av mikroglia. For å overvinne disse problemene, en forenklet metode for ikke-invasivt transplantasjon indusert pluripotent stamcelle-avledet menneskelig mikroglia (iPSMG) inn i immunocompetent mus hjernen via en transnasal rute i kombinasjon med farmakologisk uttømming av endogene mikroglia ved hjelp av en kolonistimulerende faktor 1 reseptor (CSF1R) antagonist er utviklet. Denne protokollen gir en måte å ikke-invasivt transplantere celler inn i musehjernen og kan derfor være verdifull for å evaluere in vivo-rollen til menneskelig mikroglia i fysiologiske og patologiske hjernefunksjoner.
Mikroglia er en spesialisert populasjon av makrofaglignende celler i sentralnervesystemet (CNS) og spiller viktige roller i å kontrollere ulike hjernefunksjoner som nevral kretsutvikling, modulere nevrotransmisjon og opprettholde hjernens homeostase 1,2,3. Selv om murin mikroglia deler mange funksjoner med de fra mennesker, viser de artsspesifikke forskjeller. Dermed kan responsen av musmikroglia til ulike stimuli ikke alltid representere den til menneskelig mikroglia 4,5,6. Selv om mange studier har analysert menneskelig mikroglia, er disse eksperimentene begrenset til in vitro-studier. In vitro kultivert menneskelig mikroglia viser morfologiske trekk og genuttrykk som er svært forskjellige fra de in vivo. Dermed kan in vitro-eksperimenter ikke alltid kapitulere in vivo-egenskapene til menneskelig mikroglia. Derfor er det nødvendig med et eksperimentelt system for å studere menneskelig mikroglia in vivo.
Nylig, for å studere in vivo-egenskapene til human mikroglia, blir in vitro generert induserte pluripotente stamceller (iPSCer) – eller embryonale stamceller-avledet menneskelig mikroglia kirurgisk transplantert i mus hjerne 7,8,9,10,11,12,13,14. Ved hjelp av denne tilnærmingen har ulike in vivo-egenskaper av menneskelig mikroglia blitt karakterisert. Imidlertid er den utbredte bruken av denne metoden begrenset av to grunner. Først er kravet til immundefektende mus. For å studere rollen som menneskelig mikroglia i ulike nevrodegenerative sykdommer, må sykdomsmutasjonsbærende mus krysses inn i immunmangelmus, noe som krever betydelig tid og krefter. Videre, i ulike nevrologiske lidelser, perifere immunceller, som T-celler, kan modulere mikrogliale funksjoner 15,16,17. Derfor kan eksperimenter utført i immundefektende mus ikke representere bona fide egenskaper av menneskelig mikroglia in vivo. For det andre krever invasive operasjoner for å transplantere mikroglia ekstra utstyr og trening. Videre kan hjerneskade under invasiv transplantasjon endre mikrogliale fenotyper.
I denne protokollen er ikke-invasiv transnasal transplantasjon (Tsn) av iPSMG til immunotokmpente villtypemus beskrevet18. Ved å kombinere farmakologisk ON/OFF av en CSF1R-antagonist PLX5622 som tømmer endogen musmikroglia19 og Tsn, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i musehjernen. Videre, med anvendelsen av eksogen menneskelig cytokin, forblir den transplanterte iPSMG levedyktig i 60 dager på en regionspesifikk måte uten immunsuppressiva.
Protokollen her beskriver ikke-invasiv transplantasjon av iPSMG i musehjernen. Det unike ved den nåværende protokollen er at ved å kombinere farmakologiske PLX ON/OFF-metoder og intranasal transplantasjon, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i den immunodumpente musehjernen. Transplantert iPSMG dannet flertallet av mikroglia i hippocampus og cerebellum ved å okkupere den ledige nisjen i opptil 60 dager, men ikke i cortex.
De kritiske punktene for effektiv Tsn av iPSMG er (i) uttømming effektivitet av endogene mus mikroglia (ii) administrasjon av menneskelige cytokiner hver 12 h. Mikroglia opprettholder sitt eget territorium i hjernen. Effektiv uttømming av musmikroglia er nødvendig for å gi en nisje for engraftment av transplantert iPSMG. Når uttømming av endogene musmikroglia er utilstrekkelig, observeres ikke kolonisering av musen hippocampus og cerebellum av iPSMG. Levedyktigheten til mikroglia avhenger av CSF1R og TGFBR-signalering 19,21,22. hCSF1 rapporteres å selektivt øke levedyktigheten til human mikroglia, og hTGF-β1 er nødvendig for levedyktigheten av mikroglia samt demper betennelse når den administreres hver 12 h 21,23,24. I fravær av eksogene humane cytokiner observeres ikke iPSMG i musehjernen. Videre må det tas hensyn til ikke å mekanisk aktivere iPSMG ved overdreven pipettering eller på andre måter før Tsn, da det ugjenkallelig endrer iPSMG-egenskaper samt transplantasjonseffektivitet. Hvis tilfredsstillende Tsn av iPSMG ikke er sett, må levedyktigheten av iPSMG før transplantasjon samt uttømming av endogen mikroglia bestemmes. Hvis uttømming av endogene musmikroglia ikke er mer enn 90%, kan PLX5622 fôringstid endres for å øke uttømmingen.
Sammenlignet med en konvensjonell kirurgisk transplantasjonsmetode som er invasiv og krever ekstra utstyr og trening, tillater Tsn transplantasjon på en ikke-invasiv, enkel, stabil og enkel måte. I tillegg tillater denne metoden transplantasjon av iPSMG i immunotokmpente mushjerner; Dermed kan immunokokk sykdomsmodellmus brukes til å studere responsen til iPSMG.
Den største ulempen ved den nåværende metoden er den regionale heterogeniteten i engraftmentet av iPSMG. Hvis den hjerneregionspesifikke iPSMG-transplantasjonen er nødvendig, er den nåværende protokollen ikke egnet da den transplanterte iPSMG forblir engrafert i 60 dager bare i hippocampus og cerebellum, men ikke i cortex. Videre er behovet for å administrere eksogene menneskelige cytokiner intranasalt hver 12 h også en begrensning av den nåværende protokollen, da den krever omfattende arbeidskraft og er dyrt.
Til slutt er det gitt en detaljert protokoll for Tsn av iPSMG i hjernen til immunodumpente mus. Kombinert med farmakologisk ON/OFF av musmikroglia av PLX5622, tillater denne protokollen vellykket engraftment av iPSMG. Som transplanterte celler kan observeres i hippocampus og cerebellum i en vedvarende periode når eksogene cytokiner påføres, kan den nåværende metoden være verdifull for å evaluere rollen som menneskelig mikroglia i både fysiologiske og patologiske tilstander i disse regionene.
The authors have nothing to disclose.
Tilskuddssponsorer: Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) og et Frontier Brain Science Grant fra University of Yamanashi (SK).
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |