Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка надежного биомаркера в мышиной модели сепсиса, вызванной перевязкой и пункцией,

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63584

⸱

9 декабря 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет оперативные детали перевязки и пункции слепой кишки (CLP) в мышиной модели сепсиса. CLP является одним из наиболее широко используемых методов для создания животной модели сепсиса. Поэтому для достижения надежных результатов исследований требуется стандартизированный протокол CLP.

Аннотация

Сепсис является тяжелым опасным для жизни и быстро развивающимся заболеванием, которое ежегодно вызывает миллионы смертей во всем мире. Исследователи приложили огромные усилия, чтобы прояснить патофизиологию сепсиса с использованием различных животных моделей; мышиная модель сепсиса, индуцированного перевязкой и пункцией слепой кишки (CLP), широко используется в лабораториях. Тремя техническими аспектами, которые влияют на тяжесть и воспроизводимость модели CLP, являются процент перевязанной слепой кишки, размер иглы, используемой для пункции слепой кишки, и объем фекалий, втиснутых в брюшную полость. Быстрая и специфическая диагностика сепсиса является решающим фактором, влияющим на результат. Золотым стандартом диагностики сепсиса является микробная культура; однако этот процесс отнимает много времени и иногда является неточным. Обнаружение биомаркеров, специфичных для сепсиса, происходит быстро, но существующие биомаркеры неудовлетворительны из-за короткого периода полураспада, неспецифичности и недостаточной чувствительности. Поэтому возникает острая необходимость в надежном биомаркере сепсиса на ранних стадиях. Предыдущие публикации предполагают, что чрезмерные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs) возникают при сепсисе. Цитруллинированный гистон H3 (CitH3), как компонент NET, повышен как у септических животных, так и у пациентов, а наличие CitH3 является надежным диагностическим биомаркером сепсиса. Настоящее исследование было направлено на описание стандартизированной мышиной модели CLP-индуцированного сепсиса и установление надежного биомаркера сепсиса в крови. Наша работа может способствовать ранней и точной диагностике сепсиса в будущем.

Введение

Сепсис определяется как опасная для жизни дисфункция органа, вызванная нерегулируемой реакцией хозяина на инфекцию1, а септический шок является основной причиной смерти в тяжелых случаях сепсиса2. Сепсис и септический шок ежегодно приводят к миллионам смертей во всем мире3. Ключом к улучшению исхода пациентов с сепсисом является быстрое начало лечения, такого как антибиотики4. Золотым стандартом метода диагностики сепсиса является микробная культура; однако микробная культура отнимает много времени и может привести к ложноположительным и ложноотрицательным результатам, кото....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Комитетом по обзору животных в больнице Сяня и Центральном Южном университете (No 202103149).

1. Подготовка

  1. Отбирают самцов мышей C57BL/6J (вес: 20-25 г; возраст: 8-12 недель) и размещают в течение 3 дней перед выполнением каких-либо процедур.
  2. Взвесьте мышь.
  3. Обезболить мышь 1,5% изофлураном путем вдыхания и ущипнуть пальцы ног, чтобы проверить глубину анестезии.
  4. Закрепите мышь на грелке. Нанесите крем для депиляции на живот и оставьте не дольше 1 мин перед удалением крема и волос.
    ПРИМЕ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано на рисунке 2A, CitH3 не был обнаружен в фиктивной группе с помощью вестерн-блоттинга. Концентрация CitH3 в сыворотке крови значительно увеличивалась после CLP, и это увеличение блокировалось ингибированием образования NET посредством введения YW3-56, ингибитора PAD10. На фиг.2В показаны концентрацииЦитаН3 в сыворотке крови, определяемые методом ИФА. Через 24 ч после CLP сывороточная концентрация CitH3 была увеличена .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CLP вводит патогены в брюшную полость для создания доклинической модели сепсиса. При выполнении CLP важно использовать стерильные условия для устранения интерференции экзогенных бактерий и использовать точные дозировки анестетиков16. Тремя техническими аспектами CLP, которые влияют на тяжесть и воспроизводимость модели сепсиса, являются процент перевязанной слепой кишки, размер иглы, используемой для пункции слепой кишки, и объем фекалий, втиснутых в брюшную полость. Перевязка примерно 75% слепой .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

О конфликте интересов не заявлено.

Благодарности

Мы благодарим профессора Ван Вэя и доктора Лю Шуай за помощь в проведении экспериментов. Эта работа финансировалась за счет грантов от Young Research Funding больницы Xiangya, Центрального Южного университета (No 2019Q10), От Национального и научного фонда провинции Хунань (No 2020JJ4902) и от Национального фонда естественных наук Китая (No 82202394).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
21G игла
3,3',5,5'-тетраметилбензидин НИР D Systems IncDY999
лаборатория моноклональных антител против CitH3самостоятельно разработанная
поликлональное антитело против CitH3Abcamab5103
вторичное антитело против кроликаJackson ImmunoResearch111-035-003
C57BL/6 мышейМедицинская школа Сянъя, Центральный южный университет
Cl-амидинSigma AldrichSML2250
депиляции
Dnase ISigma Aldrich11284932001
изофлуранаSigma-Aldrich26675-46-7
кетопрофенSigma AldrichPHR1375
шелковых швов (4-0 & 6-0)
хирургические инструменты& НБСП;
YW3-56GLPBIOGC48263
крем для

Ссылки

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Shankar-Hari, M., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель пункциибиомаркер сепсисамодель сепсиса у мышейцитруллинированный гистон H3нейтрофильные внеклеточные ловушкибиомаркер кровивестерн-блоттингнабор для ИФАингибирование PAD